Une étude récente publiée dans Biotechnologie naturelle ont révélé le développement de variants Cas13 haute fidélité avec des effets collatéraux nettement réduits par mutagenèse et ont démontré la faisabilité de hfCas13 pour une dégradation efficace de l’ARN sur cible avec presque aucun dommage collatéral dans les cellules de mammifères et les animaux.
Ce travail a été réalisé par des chercheurs du laboratoire du Dr Yang Hui à l’Institut des neurosciences, du Centre d’excellence en science du cerveau et en technologie de l’intelligence de l’Académie chinoise des sciences, du Laboratoire d’État clé des neurosciences et de l’équipe de R&D de HuiGene Therapeutics Co., Ltd.
Le système CRISPR-Cas13 est un outil très efficace pour le ciblage programmable de l’ARN, et a été exploité pour la détection d’acide nucléique et les manipulations d’ARN dans divers types de cellules et organismes. Cependant, des inquiétudes ont été soulevées concernant les effets hors ciblage de Cas13. Des études structurelles antérieures ont impliqué que lors de la liaison de Cas13 à l’ARN cible, les deux domaines de la nucléase HEPN pourraient former un site catalytique à la surface de la protéine, offrant un potentiel de clivage promiscuité des ARN témoins en dehors du clivage sur cible des ARN cibles.
En raison de ce soi-disant effet collatéral, Cas13 pourrait dégrader au hasard les ARN cibles et non cibles, ce qui rend difficile la conception d’expériences et l’interprétation des résultats lors de l’utilisation de Cas13.
Par conséquent, des tentatives pour diminuer ou éliminer la dégradation de l’ARN par des approches d’ingénierie sont nécessaires pour la recherche fondamentale et les futures applications in vivo du système Cas13.
Les chercheurs ont conçu un système de plasmide rapporteur à double fluorescence (EGFP et mCherry) pour détecter les effets collatéraux de Cas13 dans les cellules de mammifères. Dans ce système, la perte de cellules fluorescentes mCherry est interprétée comme une édition réussie sur cible ; la perte de cellules fluorescentes EGFP est considérée comme représentant un clivage hors cible. Les résultats ont montré que Cas13a ou Cas13d pouvaient induire des effets collatéraux significatifs.
Ensuite, les chercheurs ont cherché à concevoir Cas13d (RfxCas13d ou CasRx, Cas13d de Ruminococcus flavefaciens XPD3002) par mutagenèse et à cribler des variantes avec des effets collatéraux minimes, sur la base d’un nouveau système rapporteur à double fluorescence bien conçu composé d’un seul plasmide contenant EGFP, mCherry , et l’ARNg ciblant l’EGFP, avec chaque variante Cas13.
L’équipe de Yang a conçu et généré une bibliothèque de mutagenèse de variantes Cas13d et les a transfectées individuellement dans des cellules HEK293. En analysant la fluorescence du rapporteur à l’aide de la cytométrie en flux, cinq variantes (N1V7, N2V7, N2V8, N3V7 et N15V4) présentaient un pourcentage relativement faible de cellules EGFP+ mais un pourcentage élevé de cellules mCherry+, indiquant une activité ciblée élevée avec une activité collatérale réduite.
La variante N2V8, appelée Cas13d haute fidélité (hfCas13d) pour sa spécificité la plus élevée pour la dégradation de l’ARN, a été utilisée pour une caractérisation plus poussée, y compris une analyse hors cible à l’échelle du transcriptome à l’aide du séquençage de l’ARN. Le hfCas13d a montré une réduction marquée du nombre de gènes hors cible lors du ciblage de plusieurs transcrits endogènes, tels que PPIA. De plus, les variants hfCas13 n’ont montré aucun dommage collatéral détectable dans les lignées cellulaires, les animaux transgéniques et les cellules somatiques, ce qui confirme leurs applications in vivo.
Surtout, Yang et son équipe ont identifié le système CRISPR-Cas13X en 2021, le plus petit outil d’édition d’ARN (seulement 775 acides aminés) à l’heure actuelle. Dans leur nouvelle étude, les chercheurs ont en outre conçu Cas13X et obtenu une variante hfCas13X présentant une spécificité élevée de la dégradation de l’ARN sur la cible mais des effets collatéraux minimes. hfCas13X montrera un grand potentiel d’application dans le domaine de la thérapie génique basée sur l’édition d’ARN.
Ce travail a été publié en ligne dans Biotechnologie naturelle le 11 août 2022. Tong Huawei, Huang Jia, Xiao Qingquan, He Bingbing, Dong Xue et Liu Yuanhua sont les co-premiers auteurs à contributions égales.
Huawei Tong et al, variantes Cas13 haute fidélité pour la dégradation ciblée de l’ARN avec des effets collatéraux minimes, Biotechnologie naturelle (2022). DOI : 10.1038/s41587-022-01419-7