Par rapport à la protéine purifiée in vitro, les macromolécules biologiques intracellulaires présentent une conformation plus complète et physiologique. Par conséquent, l’étude de la structure tridimensionnelle des protéines directement in vivo est le prochain objectif de la biologie structurale et également la frontière du développement de la technologie de cryo-microscopie électronique (cryo-EM).
Les cellules doivent être amincies en lamelles d’environ 150 nm pour répondre à l’exigence d’épaisseur de l’imagerie cryo-EM, et un faisceau d’ions focalisé (FIB) est utilisé pour produire les lamelles qualifiées en fraisant la cellule congelée avec des faisceaux d’ions à haute énergie. Cependant, le FIB endommage les lamelles pendant le fraisage sur les surfaces supérieure et inférieure, et une analyse expérimentale quantitative des dommages n’a pas encore été effectuée et la manière de réduire les dommages est inconnue.
Dans une étude publiée dans Structuredes chercheurs de l’Institut de biophysique de l’Académie chinoise des sciences ont présenté une méthode d’analyse quantitative des dommages cryo-FIB et ont démontré que le polissage par faisceau à faible énergie était essentiel pour produire des lamelles plus fines de haute qualité.
Ce travail établit une nouvelle méthode pour quantifier les dommages du FIB aux lamelles cellulaires. Les protéines des lamelles cellulaires sont regroupées en fonction de la distance des surfaces par la reconstruction par tomographie électronique. Sur la base de la reconstruction 3D des protéines de chaque groupe, les chercheurs ont calculé le rapport signal sur bruit (SNR) moyen des protéines de chaque groupe. Les SNR moyens reflétaient la qualité des données de la protéine dans différents groupes et représentaient également le degré de dommage du FIB à la protéine à différentes distances des surfaces de manière quantification.
La recherche a révélé que le FIB causait des dommages non négligeables à une profondeur de 50 nm à la surface des lamelles. Les dommages à la surface étaient similaires à ceux d’une exposition à 16 e–/Å2 dans un microscope cryoélectronique de 300 kV et les dommages étaient de 3,5 e–/Å2 dans la région d’environ 50 nm. Les résultats signifient que lorsque l’épaisseur de la lamelle est inférieure à 100 nm, les dommages des deux surfaces seront doublés dans la région centrale, entraînant des dommages supérieurs à 7 e–/Å2 avant l’exposition.
Théoriquement, pour atteindre une résolution de reconstruction 3D plus élevée, l’épaisseur de la lamelle cellulaire doit être aussi fine que possible. Cependant, le FIB endommagera toutes les protéines de la lamelle d’une épaisseur inférieure à 100 nm. Une telle contradiction rendra difficile l’obtention de la reconstruction 3D avec une résolution quasi atomique pour les lamelles broyées par FIB. Afin de briser la limitation de la profondeur des dommages sur l’épaisseur minimale de la lamelle, d’autres recherches ont montré que l’épaisseur de la couche endommagée peut être réduite à moins de 30 nm en réduisant la tension de fraisage du FIB à 8 keV.
L’amélioration de la résolution est essentielle pour l’étude des protéines in situ, et l’obtention de lamelles de haute qualité est une condition préalable importante pour améliorer la résolution de la reconstruction 3D. Ce travail a non seulement fourni un outil pour mesurer qualitativement la qualité des lamelles, mais a également proposé un schéma pour réduire les dommages FIB dans les cryo-lamelles, ce qui est propice à une amélioration supplémentaire de la résolution de l’analyse de la structure in situ.
Plus d’information:
Qi Yang et al, La réduction des dommages FIB sur la cryo-lamelle en abaissant l’énergie du faisceau ionique révélée par une analyse quantitative, Structure (2023). DOI : 10.1016/j.str.2023.07.002