Un nouvel outil basé sur CRISPR insère de grandes séquences d’ADN aux sites souhaités dans les cellules

S’appuyant sur le système d’édition de gènes CRISPR, les chercheurs du MIT ont conçu un nouvel outil capable de supprimer les gènes défectueux et de les remplacer par de nouveaux, de manière plus sûre et plus efficace.

En utilisant ce système, les chercheurs ont montré qu’ils pouvaient délivrer des gènes aussi longs que 36 000 paires de bases d’ADN à plusieurs types de cellules humaines, ainsi qu’aux cellules hépatiques de souris. La nouvelle technique, connue sous le nom de PASTE, pourrait être prometteuse pour le traitement de maladies causées par des gènes défectueux avec un grand nombre de mutations, comme la fibrose kystique.

« C’est une nouvelle façon génétique de cibler potentiellement ces maladies très difficiles à traiter », déclare Omar Abudayyeh, un boursier McGovern au McGovern Institute for Brain Research du MIT. « Nous voulions travailler sur ce que la thérapie génique était censée faire à ses débuts, c’est-à-dire remplacer les gènes, et pas seulement corriger les mutations individuelles. »

Le nouvel outil combine le ciblage précis de CRISPR-Cas9, un ensemble de molécules dérivées à l’origine des systèmes de défense bactériens, avec des enzymes appelées intégrases, que les virus utilisent pour insérer leur propre matériel génétique dans un génome bactérien.

« Tout comme CRISPR, ces intégrases proviennent de la bataille en cours entre les bactéries et les virus qui les infectent », explique Jonathan Gootenberg, également membre de McGovern. « Cela montre comment nous pouvons continuer à trouver une abondance de nouveaux outils intéressants et utiles à partir de ces systèmes naturels. »

Gootenberg et Abudayyeh sont les principaux auteurs de la nouvelle étude, qui paraît aujourd’hui dans Biotechnologie naturelle. Les principaux auteurs de l’étude sont les associés techniques du MIT Matthew Yarnall et Rohan Krajeski, l’ancienne étudiante diplômée du MIT Eleonora Ioannidi et l’étudiante diplômée du MIT Cian Schmitt-Ulms.

Insertion d’ADN

Le système d’édition de gènes CRISPR-Cas9 se compose d’une enzyme coupant l’ADN appelée Cas9 et d’un court brin d’ARN qui guide l’enzyme vers une zone spécifique du génome, dirigeant Cas9 où faire sa coupe. Lorsque Cas9 et l’ARN guide ciblant un gène de la maladie sont délivrés dans les cellules, une coupe spécifique est effectuée dans le génome et les processus de réparation de l’ADN des cellules collent la coupe ensemble, supprimant souvent une petite partie du génome.

Si une matrice d’ADN est également délivrée, les cellules peuvent incorporer une copie corrigée dans leurs génomes pendant le processus de réparation. Cependant, ce processus oblige les cellules à faire des cassures double brin dans leur ADN, ce qui peut provoquer des délétions ou des réarrangements chromosomiques nocifs pour les cellules. Une autre limitation est qu’il ne fonctionne que dans les cellules qui se divisent, car les cellules qui ne se divisent pas n’ont pas de processus de réparation de l’ADN actifs.

L’équipe du MIT voulait développer un outil capable de découper un gène défectueux et de le remplacer par un nouveau sans induire de cassure de l’ADN double brin. Pour atteindre cet objectif, ils se sont tournés vers une famille d’enzymes appelées intégrases, que des virus appelés bactériophages utilisent pour s’insérer dans les génomes bactériens.

Pour cette étude, les chercheurs se sont concentrés sur les intégrases à sérine, qui peuvent insérer d’énormes morceaux d’ADN, pouvant atteindre 50 000 paires de bases. Ces enzymes ciblent des séquences génomiques spécifiques connues sous le nom de sites de fixation, qui fonctionnent comme des « patins d’atterrissage ». Lorsqu’ils trouvent la bonne plateforme d’atterrissage dans le génome de l’hôte, ils s’y lient et intègrent leur charge utile d’ADN.

Dans des travaux antérieurs, les scientifiques ont trouvé difficile de développer ces enzymes pour la thérapie humaine car les aires d’atterrissage sont très spécifiques et il est difficile de reprogrammer des intégrases pour cibler d’autres sites. L’équipe du MIT s’est rendu compte que la combinaison de ces enzymes avec un système CRISPR-Cas9 qui insère le bon site d’atterrissage permettrait une reprogrammation facile du puissant système d’insertion.

Le nouvel outil, PASTE (Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements), comprend une enzyme Cas9 qui coupe sur un site génomique spécifique, guidée par un brin d’ARN qui se lie à ce site. Cela leur permet de cibler n’importe quel site du génome pour l’insertion du site d’atterrissage, qui contient 46 paires de bases d’ADN. Cette insertion peut se faire sans introduire de cassure double brin en ajoutant d’abord un brin d’ADN via une transcriptase inverse fusionnée, puis son brin complémentaire.

Une fois le site d’atterrissage incorporé, l’intégrase peut arriver et insérer sa charge utile d’ADN beaucoup plus grande dans le génome de ce site.

« Nous pensons qu’il s’agit d’un grand pas vers la réalisation du rêve d’une insertion programmable d’ADN », déclare Gootenberg. « C’est une technique qui peut être facilement adaptée à la fois au site que nous voulons intégrer et à la cargaison. »

Remplacement de gène

Dans cette étude, les chercheurs ont montré qu’ils pouvaient utiliser PASTE pour insérer des gènes dans plusieurs types de cellules humaines, notamment les cellules hépatiques, les cellules T et les lymphoblastes (globules blancs immatures). Ils ont testé le système de délivrance avec 13 gènes de charge utile différents, dont certains pourraient être utiles sur le plan thérapeutique, et ont pu les insérer à neuf endroits différents du génome.

Dans ces cellules, les chercheurs ont pu insérer des gènes avec un taux de réussite allant de 5 à 60 %. Cette approche a également produit très peu d’« indels » indésirables (insertions ou délétions) aux sites d’intégration des gènes.

« Nous voyons très peu d’indels, et comme nous ne faisons pas de ruptures double brin, vous n’avez pas à vous soucier des réarrangements chromosomiques ou des suppressions à grande échelle des bras chromosomiques », explique Abudayyeh.

Les chercheurs ont également démontré qu’ils pouvaient insérer des gènes dans des foies « humanisés » de souris. Les foies de ces souris sont constitués d’environ 70 % d’hépatocytes humains, et PASTE a réussi à intégrer de nouveaux gènes dans environ 2,5 % de ces cellules.

Les séquences d’ADN que les chercheurs ont insérées dans cette étude comportaient jusqu’à 36 000 paires de bases, mais ils pensent que des séquences encore plus longues pourraient également être utilisées. Un gène humain peut compter de quelques centaines à plus de 2 millions de paires de bases, bien qu’à des fins thérapeutiques, seule la séquence codante de la protéine doive être utilisée, ce qui réduit considérablement la taille du segment d’ADN qui doit être inséré dans le génome.

Les chercheurs explorent maintenant davantage la possibilité d’utiliser cet outil comme moyen possible de remplacer le gène défectueux de la fibrose kystique. Cette technique pourrait également être utile pour traiter les maladies du sang causées par des gènes défectueux, comme l’hémophilie et le déficit en G6PD, ou la maladie de Huntington, un trouble neurologique causé par un gène défectueux qui a trop de répétitions de gène.

Les chercheurs ont également mis à disposition leurs constructions génétiques en ligne à utiliser par d’autres scientifiques.

« L’un des aspects fantastiques de l’ingénierie de ces technologies moléculaires est que les gens peuvent s’appuyer sur elles, les développer et les appliquer d’une manière à laquelle nous n’avions peut-être pas pensé ou n’avions pas pensé », déclare Gootenberg. « C’est vraiment formidable de faire partie de cette communauté émergente. »

Cette histoire est republiée avec l’aimable autorisation de MIT News (web.mit.edu/newsoffice/), un site populaire qui couvre l’actualité de la recherche, de l’innovation et de l’enseignement au MIT.