Les répétitions palindromes courtes et régulièrement espacées (CRISPR) et la protéine 9 associée à Crispr (CRISPR/Cas9) est désormais une méthode révolutionnaire bien connue pour concevoir des cellules microbiennes.
Un avantage clé de CRISPR réside dans la conception de la souche pour faciliter l’intégration chromosomique afin de permettre l’assemblage d’ADN sans marqueur. Ces systèmes d’édition sont très bénéfiques ; cependant, leur assemblage n’est pas tout à fait simple et peut empêcher son utilisation et ses applications.
Dans un nouveau rapport en Nature Communications Biologie, Tigran V. Yuzbashev et une équipe de recherche ont identifié les limites des boîtes à outils Cas9 existantes conçues pour rendre les techniques CRISPR plus faciles d’accès et de mise en œuvre. Ils ont discuté de trois méthodes différentes bien établies et les ont combinées pour former une boîte à outils complète pour une ingénierie métabolique efficace en utilisant CRISPR/Cas9.
Une boîte à outils unique composée de 147 plasmides pour générer et caractériser une bibliothèque de 137 promoteurs afin de construire un acide homogentisique dans le laboratoire.
Modifications du génome avec CRISPR/Cas9
Le système CRISPR/Cas9 peut produire des modifications génomiques rapides, précises et sans cicatrices, offrant ainsi une marge significative pour concevoir des souches microbiennes pour la bioproduction. L’ingénierie métabolique des levures, par exemple, constitue un domaine en croissance rapide en biologie technique pour la production durable de produits chimiques, de carburants, aliments et produits pharmaceutiques.
Les levures ont un potentiel métabolique comme les cellules eucaryotes et sont donc plus faciles à concevoir et à cultiver à grande échelle. En conséquence, les bioingénieurs ont conçu et développé Systèmes CRISPR pour levures.
En raison de sa grande efficacité, CRISPR permet des modifications génomiques sans marqueur. Dans ce travail, Yuzbashev a assuré l’optimisation des souches et facilité les projets d’ingénierie métabolique en identifiant trois améliorations du système CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie des levures. Les méthodes comprenaient : 1) l’échange facile entre les modifications avec et sans marqueur, 2) l’échange rapide des bras d’homologie pour déterminer différents emplacements d’intégration, et 3) une méthode simple de clonage ARNg.
Intégration sans marqueur
Pour permettre une intégration sans marqueur basée sur CRISPR, l’équipe a choisi une cassure double brin induite par Cas9, qui devait être réparée pour accomplir la prolifération cellulaire. Les scientifiques ont rendu cela possible en utilisant un modèle ou un donneur, intégré par recombinaison homologue ou jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) – sans intégration. Le processus de jonction d’extrémités non homologues est observé chez la plupart des espèces fongiques, y compris la levure de boulanger. Saccharomyces cerevisiae.
Chez les espèces présentant un mécanisme NHEJ prédominant, l’équipe a amélioré la recombinaison homologue en supprimant les gènes NHEJ. Si une méthode sans marqueur n’a pas réussi, les scientifiques visent ensuite à améliorer l’intégration assistée par CRISPR-Cas9 pour revenir facilement à l’intégration basée sur des marqueurs.
Redirection de l’ADN du donneur
L’intégration assistée par Cas9 nécessite généralement un modèle de donneur constitué d’une cassette intégrée flanquée de deux bras d’homologie. L’équipe a émis l’hypothèse que l’intégration idéale de CRISPR/Cas9 devrait échanger des bras d’homologie sur des constructions de donneurs Cas9 pré-évaluées via un modèle simplifié. Réaction de l’Assemblée du Golden Gate.
De plus, les promoteurs sont un élément clé de tout projet d’ingénierie métabolique visant à rediriger les flux vers le produits d’intérêt. Yuzbashev et al. utilisé la levure industrielle Yarrowia lipolytica développer une boîte à outils d’ingénierie métabolique combinant des stratégies d’édition de gènes et d’assemblage d’ADN pour une efficacité et une polyvalence élevées.
Architecture modulaire de la boîte à outils et ingénierie des voies métaboliques
Les scientifiques ont libéré tout le potentiel de CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie métabolique en développant une boîte à outils s’étendant sur autrefois bien connu Systèmes d’assemblage Golden Gate. Ils ont testé le système de criblage en générant plusieurs bibliothèques de promoteurs. Yuzbashev et al. a choisi les gènes ribosomiques de Y. lipolytica codant pour des protéines de grandes et petites sous-unités. Ils ont identifié une variété de promoteurs dotés de forces diverses afin d’augmenter le nombre de promoteurs pour le même organisme.
Pour prouver l’influence et l’utilisation de la méthode CRISPR/Cas9 améliorée, l’équipe a créé un Y. lipolytica via une ingénierie rationnelle pour produire un acide homogentisique (HGA) . Généralement, dans des conditions alcalines, le HGA subit spontanément une oxydation pour former des substances autopolymérisées. pyomélanine; un excellent constituant de crèmes solaires et cosmétiques naturels.
Malgré son potentiel commercial élevé, les méthodes existantes pour produire le précurseur acide et le produit pyomélanine reposaient sur la biotransformation de acides aminés aromatiques coûteux. Pour faciliter l’ingénierie métabolique, l’équipe a donc d’abord sélectionné plusieurs gènes codant pour leaminotransférases aromatiques précurseurs comme cibles d’ingénierie. Ils ont ensuite sélectionné trois cibles de surexpression pour améliorer la synthèse de novo de l’acide homogentisique dans l’organisme modèle. Enfin, ils ont étudié et inactivé la voie de dégradation du HGA ; une voie encore inconnue chez Y. lipolytica.
Perspectives
De cette manière, Tigran V. Yuzbashev et ses collègues ont montré la dépendance de l’ingénierie métabolique des organismes vivants à l’égard de méthodes efficaces de manipulation de l’ADN. Ce travail présente un exemple de boîte à outils moléculaire améliorée conçue pour l’ingénierie métabolique basée sur CRISPR/Cas9.
Les scientifiques ont prouvé la fonctionnalité de la plateforme à la fois pour la construction rapide de souches et pour la caractérisation d’une vaste bibliothèque de promoteurs. Ils s’attendent à ce que cette boîte à outils ait des applications plus larges dans l’ingénierie des déformations et dans l’industrie. L’équipe envisage que le modèle Y. lipolytica développé dans ce travail ait également des applications globales dans d’autres domaines du génie biologique.
Plus d’information:
Tigran V. Yuzbashev et al, Une boîte à outils d’assemblage d’ADN pour libérer le potentiel CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie métabolique, Biologie des communications (2023). DOI : 10.1038/s42003-023-05202-5
Guri Giaever et al, Profilage fonctionnel du génome de Saccharomyces cerevisiae, Nature (2002). DOI : 10.1038/nature00935
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