Dans un étude récente Publié dans iScience, les chercheurs ont optimisé le système Tet-On pour améliorer l’efficacité de la génération de cellules musculaires squelettiques et d’autres types de cellules différenciées à partir des iPSC à diverses fins de recherche fondamentale et clinique. L’équipe était dirigée par le professeur agrégé Hidetoshi Sakurai (Département d’application clinique) et le professeur agrégé Knut Woltjen (Département des frontières des sciences de la vie).
L’hétérogénéité constitue un défi crucial pour les chercheurs souhaitant produire des cellules et des tissus différenciés à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Par exemple, la contamination par des cellules indifférenciées ou partiellement différenciées entraîne des problèmes de reproductibilité et de sécurité respectivement pour la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire.
Le système d’expression génique inductible par la tétracycline (Tet-On) est un outil génétique fondamental utilisé par les chercheurs pour réguler l’expression transgénique en réponse à la doxycycline, un antibiotique courant. Plus précisément, le système est basé sur la capacité du transactivateur inverse de la tétracycline (rtTA) à se lier au promoteur Tet-On, constitué de répétitions de l’opéron Tet et au promoteur minimal du cytomégalovirus (CMV), uniquement en présence d’un médicament appelé doxycycline pour activer l’expression des gènes exogènes.
Sa facilité d’utilisation permet aux chercheurs d’initier une différenciation directe des iPSC en différents types de cellules. Cependant, l’activation non uniforme du transgène reste problématique et les chercheurs doivent donc évaluer et sélectionner les clones iPSC pour identifier ceux qui expriment le transgène d’intérêt de manière efficace et stable.
Pour résoudre le problème de l’hétérogénéité, les chercheurs sont d’abord revenus à l’essentiel pour identifier la cause profonde de l’échec de l’activation du transgène. Étant donné que la surexpression de MYOD1 est la méthode d’induction préférée pour piloter la différenciation myogénique des iPSC, les chercheurs ont d’abord examiné la capacité d’un système d’expression de transposase piggyBac à surexprimer MYOD1 (avec mCherry comme protéine rapporteuse fluorescente pour indiquer l’expression de MYOD1 en parallèle), rtTA et néomycine. marqueur de sélection positif de résistance (aux antibiotiques).
Après avoir introduit le système piggyBac dans les iPSC et sélectionné les cellules avec le système intégré dans leur génome, les cellules ont été traitées à la doxycycline pour initier la différenciation myogénique. Les chercheurs ont notamment découvert que toutes les cellules n’exprimaient pas MYOD1, ce qui suggère que de nombreuses cellules ne parvenaient pas à activer le transgène.
Pour déterminer la cause, ils ont séparé les cellules avec et sans mCherry, en fonction du signal de fluorescence qu’elles émettaient, pour une analyse plus approfondie. Fait intéressant, bien qu’ils aient constaté que les cellules non fluorescentes contenaient le gène exogène, l’expression du rtTA était beaucoup plus faible que celle des cellules fluorescentes.
Sur la base de cette observation, les chercheurs ont testé si le fait de compléter l’expression de rtTA améliorerait l’efficacité de la différenciation myogénique. Comme ils l’avaient émis l’hypothèse, la supplémentation en rtTA augmentait l’efficacité de la différenciation d’environ 40 % à plus de 80 %, indiquant ainsi que l’expression de rtTA pourrait constituer un goulot d’étranglement pour la différenciation des iPSC.
Les chercheurs ont ensuite examiné un autre facteur susceptible d’influencer l’expression du transgène : le marqueur de sélection positive de la résistance aux antibiotiques. Pour tester ce paramètre, ils ont remplacé le transgène de résistance à la néomycine par un transgène codant pour la résistance à la puromycine dans le système piggyBac. Étonnamment, même si les cellules avaient moins de copies du transgène résistant à la puromycine, non seulement elles exprimaient des niveaux élevés de mCherry et de rtTA, mais la proportion relative de cellules exprimant la protéine rapporteuse fluorescente était significativement augmentée simplement en changeant de résistance aux antibiotiques.
Les chercheurs ont ensuite testé si ce changement favoriserait l’expression uniforme de MYOD1 et la différenciation myogénique. En effet, ils ont obtenu de manière reproductible une efficacité de différenciation de plus de 90 % en utilisant à la place la sélection de la résistance à la puromycine.
En optimisant les facteurs décrits et d’autres paramètres, l’équipe de recherche a montré qu’elle pouvait différencier avec succès les iPSC en cellules musculaires squelettiques avec une efficacité suffisante pour que l’évaluation et la sélection des clones ne soient pas nécessaires. Forts de ces nouvelles connaissances, les chercheurs peuvent adopter des stratégies similaires pour d’autres méthodes de différenciation nécessaires à la génération de divers types de cellules pour une modélisation reproductible des maladies et une thérapie cellulaire sûre.
Plus d’information:
Jun Otomo et al, L’activation uniforme du transgène dans les systèmes Tet-On dépend de l’expression soutenue du rtTA, iScience (2023). DOI : 10.1016/j.isci.2023.107685