La microscopie à deux photons (TPM) a révolutionné le domaine de la biologie en permettant aux chercheurs d’observer des processus biologiques complexes dans les tissus vivants à haute résolution. Contrairement aux techniques traditionnelles de microscopie à fluorescence, la TPM utilise des photons à faible énergie pour exciter les molécules fluorescentes pour l’observation. Ceci, à son tour, permet de pénétrer beaucoup plus profondément dans le tissu et garantit que les molécules fluorescentes, ou fluorophores, ne sont pas endommagées de manière permanente par le laser d’excitation.
Cependant, certains processus biologiques sont tout simplement trop rapides pour être enregistrés, même avec des TPM de pointe. L’un des paramètres de conception qui limite les performances d’un TPM est la fréquence de balayage de ligne, mesurée en images par seconde (FPS). Cela fait référence à la vitesse à laquelle l’échantillon cible peut être balayé par le laser d’excitation dans une direction (par exemple, dans un balayage horizontal). Une fréquence de balayage lente a également un impact sur le FPS global du système, car elle détermine la vitesse à laquelle le laser peut être balayé dans l’autre direction, c’est-à-dire dans un balayage vertical. Ensemble, ceux-ci créent un compromis entre la résolution temporelle du microscope et la taille du cadre d’observation.
Pour contourner ce problème, une équipe internationale de chercheurs chinois et allemands a récemment développé une puissante configuration TPM avec une fréquence de balayage de ligne sans précédent. Selon leur rapport publié dans Neurophotoniquece système de microscopie a été conçu pour l’imagerie de processus biologiques rapides à haute résolution temporelle et spatiale.
L’un des facteurs clés qui distinguent le TPM proposé des modèles conventionnels est l’utilisation de déflecteurs acousto-optiques (AOD) pour contrôler le balayage du laser d’excitation. Un AOD est un type spécial de cristal dont l’indice de réfraction peut être contrôlé avec précision par des ondes acoustiques. Ceci, à son tour, nous permet de rediriger un faisceau laser à travers celui-ci comme vous le souhaitez. Plus important encore, les AOD permettent un guidage laser plus rapide que celui obtenu avec les galvanomètres utilisés dans les TPM conventionnels.
En conséquence, l’équipe a conçu un AOD personnalisé avec une vitesse acoustique exceptionnellement élevée à l’aide d’un cristal de dioxyde de tellure (TeO2), atteignant une fréquence de balayage de ligne élevée. Avec cet AOD, le laser pouvait balayer une ligne dans le cadre en seulement 2,5 microsecondes, ce qui correspond à une fréquence de balayage de ligne maximale de 400 kHz. De même, l’équipe a utilisé un AOD pour obtenir une fréquence de balayage lente raisonnable dans l’autre sens.
Pour améliorer encore l’adaptabilité de leur microscope, l’équipe a ajouté la possibilité de passer à un mécanisme de balayage laser basé sur un galvanomètre si nécessaire. Cela a permis le balayage de grandes régions de l’échantillon à une résolution et à une vitesse acceptables, ce qui a facilité la localisation de petites zones d’intérêt avant de passer au balayage AOD.
L’équipe a mené plusieurs expériences de preuve de concept avec le TPM nouvellement conçu. Ils ont installé des fenêtres crâniennes sur des souris génétiquement modifiées et les ont utilisées pour observer la morphologie et l’activité des neurones ainsi que le mouvement des globules rouges (RBC). Le système a atteint une fréquence d’images allant jusqu’à 10 000 FPS en utilisant une configuration AOD et une taille d’image appropriées. Cela était suffisant pour mesurer avec précision la vitesse à laquelle le calcium se propage dans les dendrites neuronales ainsi que pour visualiser la trajectoire des globules rouges individuels dans les vaisseaux sanguins.
Impressionné par ces résultats, le Dr Na Ji, rédacteur en chef adjoint de Neurophotonique et Luis Alvarez Memorial Chair in Experimental Physics à l’UC Berkeley, remarque : « Le nouveau système de microscopie à balayage basé sur AOD représente une amélioration substantielle de la vitesse et des performances d’imagerie, comme en témoigne son application pour la propagation du signal calcique et les mesures du débit sanguin dans le cerveau invivo. »
À l’avenir, la nouvelle conception TPM de preuve de concept permettra de capturer des processus biologiques rapides et pourrait améliorer considérablement notre compréhension de ceux-ci.
Plus d’information:
Ruijie Li et al, Imagerie par microscopie à deux photons à dix kilohertz de l’activité dendritique unicellulaire et de l’hémodynamique in vivo, Neurophotonique (2023). DOI : 10.1117/1.NPh.10.2.025006