Microscopie STED dans le domaine fréquentiel pour la suppression sélective du bruit de fond

La nanoscopie décrit la capacité de voir au-delà de la limite optique généralement acceptée de 200 à 300 nm. La microscopie à épuisement par émission stimulée (STED), développée par Stefan W. Hell et Jan Wichmann en 1994, et démontrée expérimentalement par Hell et Thomas Klar en 1999, est une technique de super-résolution pour la nanoscopie. La microscopie STED a fait des progrès considérables et est largement utilisée dans la recherche pratique. Mais son utilisation pratique implique un bruit de fond indésirable, qui affecte négativement la résolution spatiale et la qualité de l’image. En général, ce bruit provient de deux sources de signal : (i) la fluorescence générée par la réexcitation provoquée par des doses de lumière ultra-élevées provenant du faisceau d’appauvrissement ; et (ii) fluorescence résiduelle, due à un appauvrissement insuffisant du faisceau d’inhibition.

D’importantes approches d’élimination du bruit de fond ont été développées au cours des dernières décennies. Ceux-ci peuvent être divisés en trois catégories : domaine temporel, domaine spatial et domaine de phaseur. Certaines de ces méthodes existent depuis longtemps et d’autres ont été développées plus récemment. Bien que des moyens puissants pour supprimer le bruit indésirable des images de microscopie STED, ils comportent tous des inconvénients, notamment une distorsion de l’image, des temps d’acquisition prolongés ou l’introduction de bruit de tir. La microscopie STED n’a pas encore atteint son plein potentiel.

Comme rapporté dans Photonique avancée, des chercheurs de l’Université du Zhejiang ont récemment développé une nouvelle méthode appelée « différence à double modulation » STED (dmdSTED) pour supprimer les bruits de fond de manière sélective et efficace. La méthode fonctionne en triant les signaux du domaine spatial dans le domaine fréquentiel de sorte que la fluorescence non appauvrie et le fond induit par STED soient commodément séparés des signaux fluorescents souhaités. Les faisceaux d’excitation et d’appauvrissement sont chargés respectivement avec des modulations temporelles différentes. Puisqu’il évite la réexcitation provoquée par le faisceau d’appauvrissement, un laser d’appauvrissement avec une longueur d’onde plus proche du pic du spectre d’émission de fluorescence de l’échantillon peut être sélectionné, réduisant ainsi l’intensité d’appauvrissement requise.

La version actuelle de dmdSTED fonctionne avec une résolution spatiale de λ/8, une résolution supérieure à celle des méthodes de domaine de phaseur (par exemple, SPLIT, λ/5) qui sont sujettes au bruit de grenaille. Théoriquement, la perte potentielle de signal par des approches dans le domaine temporel (comme le déclenchement temporel) peut être évitée par cette approche. De plus, dmdSTED est compatible avec les scénarios d’ondes pulsées ou continues, et le matériel pour le comptage de photons uniques corrélé dans le temps (TCSPC) n’est pas requis. Par rapport aux méthodes du domaine spatial, la résolution temporelle de dmdSTED n’est pas confinée. Ainsi, dmdSTED est avantageux dans l’acquisition d’images de microscopie très fines, en résolution spatiale, SNR et résolution temporelle.

Selon l’auteur principal Xu Liu, directeur du State Key Laboratory of Modern Optical Instrumentation, « Cette méthode dans le domaine fréquentiel possède un grand potentiel d’intégration dans d’autres techniques de balayage ponctuel à double faisceau, comme la microscopie à saturation d’état excité (ESSat), l’état de charge microscopie à appauvrissement (CSD), microscopie à appauvrissement à l’état fondamental (GSD), etc. En outre, il peut accepter davantage de types d’échantillons avec des caractéristiques spectrales différentes des colorants fluorescents couramment utilisés dans STED, tels que certains points quantiques avec un spectre d’excitation plus large.  »

Fourni par SPIE – Société internationale d’optique et de photonique