L’approbation récente d’une thérapie CRISPR-Cas9 pour la drépanocytose démontre que les outils d’édition génétique peuvent faire un excellent travail en éliminant les gènes pour guérir les maladies héréditaires. Mais il n’est toujours pas possible d’insérer des gènes entiers dans le génome humain pour les remplacer par des gènes défectueux ou délétères.
Une nouvelle technique qui utilise un rétrotransposon d’oiseaux pour insérer des gènes dans le génome est plus prometteuse pour la thérapie génique, car elle insère les gènes dans un « refuge » dans le génome humain où l’insertion ne perturbera pas les gènes essentiels ni ne conduira au cancer.
Les rétrotransposons, ou rétroéléments, sont des morceaux d’ADN qui, une fois transcrits en ARN, codent pour des enzymes qui copient l’ARN dans l’ADN du génome – un cycle égoïste qui encombre le génome d’ADN de rétrotransposons. Environ 40 % du génome humain est constitué de ce nouvel ADN « égoïste », bien que la plupart des gènes soient désactivés, appelés ADN indésirable.
La nouvelle technique, appelée Insertion précise de transgènes médiée par l’ARN, ou PRINT, exploite la capacité de certains rétrotransposons à insérer efficacement des gènes entiers dans le génome sans affecter les autres fonctions du génome. PRINT compléterait la capacité reconnue de la technologie CRISPR-Cas à désactiver des gènes, à réaliser des mutations ponctuelles et à insérer de courts segments d’ADN.
Une description de PRINT, développée dans le laboratoire de Kathleen Collins, professeur de biologie moléculaire et cellulaire à l’Université de Californie à Berkeley, est publiée le 20 février dans la revue Biotechnologie naturelle.
PRINT implique l’insertion d’un nouvel ADN dans une cellule à l’aide de méthodes d’administration similaires à celles utilisées pour transporter CRISPR-Cas9 dans les cellules pour l’édition du génome. Pour PRINT, un morceau d’ARN délivré code pour une protéine de rétroélément commune appelée protéine R2, qui comporte plusieurs parties actives, notamment une nickase (une enzyme qui se lie et coupe l’ADN double brin) et la transcriptase inverse, l’enzyme qui génère la copie d’ADN de ARN. L’autre ARN est la matrice pour l’ADN transgénique à insérer, ainsi que les éléments de contrôle de l’expression génique – une cassette transgénique autonome entière que la protéine R2 insère dans le génome, a déclaré Collins.
L’un des principaux avantages de l’utilisation de la protéine R2 est qu’elle insère le transgène dans une zone du génome qui contient des centaines de copies identiques du même gène, chacune codant pour l’ARN ribosomal, la machine à ARN qui traduit l’ARN messager (ARNm) en protéine. Avec autant de copies redondantes, lorsque l’insertion perturbe un ou quelques gènes d’ARN ribosomal, la perte des gènes ne sera pas manquée.
Placer le transgène dans une zone de sécurité évite un problème majeur rencontré lors de l’insertion de transgènes via un vecteur viral humain, qui est la méthode courante aujourd’hui : le gène est souvent inséré de manière aléatoire dans le génome, désactivant les gènes fonctionnels ou perturbant la régulation ou la fonction des gènes. , pouvant conduire au cancer.
« Une approche basée sur CRISPR-Cas9 peut réparer un nucléotide mutant ou insérer un petit morceau de fixation de séquence d’ADN. Ou vous pouvez simplement supprimer la fonction d’un gène par mutagenèse spécifique à un site », a déclaré Collins, titulaire de l’étude Walter et Ruth Schubert. Chaise familiale.
« Nous ne supprimons pas la fonction d’un gène. Nous ne réparons pas une mutation génétique endogène. Nous adoptons une approche complémentaire, qui consiste à introduire dans le génome un gène exprimé de manière autonome qui fabrique une protéine active, pour y rajouter une protéine active. » » Un gène fonctionnel comme contournement du déficit. Il s’agit d’une supplémentation transgénique au lieu d’une inversion de mutation. Pour corriger les maladies avec perte de fonction qui résultent d’une panoplie de mutations individuelles du même gène, c’est génial. «
« Les vrais gagnants étaient les oiseaux »
De nombreuses maladies héréditaires, comme la mucoviscidose et l’hémophilie, sont causées par un certain nombre de mutations différentes dans le même gène, qui désactivent toutes la fonction du gène. Toute thérapie d’édition génique basée sur CRISPR-Cas9 devrait être adaptée à la mutation spécifique d’une personne. La supplémentation génétique à l’aide de PRINT pourrait à la place fournir le bon gène à chaque personne atteinte de la maladie, permettant ainsi au corps de chaque patient de fabriquer la protéine normale, quelle que soit la mutation d’origine.
De nombreux laboratoires universitaires et startups étudient l’utilisation de transposons et de rétrotransposons pour insérer des gènes en thérapie génique. Un rétrotransposon populaire étudié par les sociétés de biotechnologie est LINE-1 (Long INterspersed Element-1), qui chez l’homme s’est dupliqué ainsi que certains gènes de l’auto-stoppeur pour couvrir environ 30 % du génome, bien que moins de 100 des rétrotransposons LINE-1 de notre génome. les copies sont fonctionnelles aujourd’hui, une infime fraction du génome.
Collins, avec Akanksha Thawani, collègue postdoctoral de l’UC Berkeley, et Eva Nogales, professeur émérite au Département de biologie moléculaire et cellulaire de l’UC Berkeley et chercheur au Howard Hughes Medical Institute, publié une structure en microscopie cryoélectronique de la protéine enzymatique codée par le rétroélément LINE-1 le 14 décembre dans la revue Nature.
Cette étude a clairement montré, a déclaré Collins, que la protéine rétrotransposon LINE-1 serait difficile à concevoir pour insérer de manière sûre et efficace un transgène dans le génome humain. Mais des recherches antérieures démontrant que les gènes insérés dans la région répétitive codant pour l’ARN ribosomal du génome (l’ADNr) s’expriment normalement ont suggéré à Collins qu’un rétroélément différent, appelé R2, pourrait mieux fonctionner pour une insertion sûre du transgène.
Parce que R2 n’est pas trouvé chez l’homme, Collins et le chercheur principal Xiaozhu Zhang et la boursière postdoctorale Briana Van Treeck, tous deux de l’UC Berkeley, ont examiné R2 à partir de plus d’une vingtaine de génomes animaux, des insectes au limule et à d’autres eucaryotes multicellulaires, pour trouver une version hautement ciblée sur les régions d’ADNr du génome humain et efficace pour insérer de longues longueurs d’ADN dans la région.
« Après en avoir chassé des dizaines, les vrais gagnants étaient les oiseaux », a déclaré Collins, notamment le diamant mandarin et le moineau à gorge blanche.
Bien que les mammifères n’aient pas R2 dans leur génome, ils possèdent les sites de liaison nécessaires pour que R2 puisse s’insérer efficacement en tant que rétroélément, ce qui est probablement un signe, a-t-elle dit, que les prédécesseurs des mammifères possédaient un rétroélément de type R2 qui, d’une manière ou d’une autre, a été expulsé de le génome des mammifères.
Dans des expériences, Zhang et Van Treeck ont synthétisé la protéine R2 codant pour l’ARNm et une matrice d’ARN qui générerait un transgène avec une protéine fluorescente exprimée par un promoteur de l’ARN polymérase. Ceux-ci ont été cotransfectés dans des cellules humaines en culture. Environ la moitié des cellules se sont allumées en vert ou en rouge en raison de l’expression d’une protéine fluorescente sous la lumière laser, démontrant que le système R2 avait réussi à insérer une protéine fluorescente fonctionnelle dans le génome.
D’autres études ont montré que le transgène s’insérait effectivement dans les régions d’ADNr du génome et qu’environ 10 copies de la matrice d’ARN pouvaient s’insérer sans perturber l’activité de fabrication de protéines des gènes d’ADNr.
Un centre de biogenèse de ribosomes géants
L’insertion de transgènes dans les régions d’ADNr du génome est avantageuse pour des raisons autres que le fait de leur donner un refuge. Les régions d’ADNr se trouvent sur les bras tronqués de cinq chromosomes distincts. Tous ces bras trapus se rassemblent pour former une structure appelée nucléole, dans laquelle l’ADN est transcrit en ARN ribosomal, qui se replie ensuite dans la machinerie ribosomale qui fabrique les protéines.
Au sein du nucléole, la transcription de l’ADNr est hautement régulée et les gènes subissent des réparations rapides, car toute cassure de l’ADNr, si on la laisse se propager, pourrait arrêter la production de protéines. En conséquence, tout transgène inséré dans la région de l’ADNr du génome serait traité avec des gants de chevreau à l’intérieur du nucléole.
« Le nucléole est un centre géant de biogenèse des ribosomes », a déclaré Collins. « Mais c’est aussi un environnement de réparation de l’ADN vraiment privilégié avec un faible risque oncogène dû à l’insertion de gènes. C’est génial que ces rétroéléments réussis – je les anthropomorphise – soient entrés dans l’ADN ribosomal. Il est multicopie, il est conservé et constitue un refuge sûr dans le sentiment que vous pouvez perturber l’une de ces copies et que la cellule s’en fiche. »
Cela fait de la région un endroit idéal pour insérer un gène destiné à la thérapie génique humaine.
Collins a admis que l’on ignore encore beaucoup de choses sur le fonctionnement de R2 et que des questions subsistent sur la biologie de la transcription de l’ADNr : combien de gènes d’ADNr peuvent être perturbés avant que la cellule ne s’en soucie ? Étant donné que certaines cellules désactivent bon nombre des plus de 400 gènes d’ADNr du génome humain, ces cellules sont-elles plus sensibles aux effets secondaires de PRINT ?
Elle et son équipe étudient ces questions, mais peaufinent également les diverses protéines et ARN impliqués dans l’insertion des rétroéléments pour que PRINT fonctionne mieux dans les cellules en culture et les cellules primaires des tissus humains.
L’essentiel, cependant, c’est que « ça marche », a-t-elle déclaré. « C’est juste que nous devons comprendre un peu plus la biologie de notre ADNr afin d’en tirer réellement parti. »
Plus d’information:
Exploiter les protéines des rétroéléments eucaryotes pour l’insertion du transgène dans les locus refuges humains, Biotechnologie naturelle (2024). DOI : 10.1038/s41587-024-02137-y
Akanksha Thawani et al, Reconnaissance de modèles et de sites cibles par la LINE-1 humaine en rétrotransposition, Nature (2023). DOI : 10.1038/s41586-023-06933-5.