La mesure du nombre et des propriétés des cellules se déplaçant dans un flux – un processus appelé cytométrie en flux – est d’une importance cruciale pour la médecine diagnostique, la recherche pharmaceutique et la science biomédicale. Aujourd’hui, des chercheurs de l’Institut national des normes et de la technologie (NIST) ont mis au point un moyen d’apporter des améliorations sans précédent à la technique.
La cytométrie en flux consiste généralement à marquer les cellules avec un matériau fluorescent, à faire briller une lumière laser dessus lorsqu’elles traversent un point particulier dans un canal fluidique de la taille d’un cheveu humain – suffisamment étroit pour que les cellules se déplacent généralement en une seule file – et à enregistrer la lumière émise par les marqueurs sur la cellule. L’analyse des émissions révèle diverses caractéristiques telles que le type de cellule, la taille, la teneur en ADN et le stade du cycle de division cellulaire.
Mais la méthode conventionnelle de mesure unique manque de moyens pour quantifier les variations de ses lectures. Par exemple, un cytomètre qui mesure les biomarqueurs du cancer peut utiliser une valeur de mesure spécifique pour décider entre des cellules saines ou malades. Une cellule peut renvoyer une valeur légèrement inférieure, l’identifiant comme saine. Mais la plage de valeurs que l’instrument pourrait renvoyer pour des mesures répétées de cette cellule est inconnue.
C’est problématique car on ne sait pas à quelle fréquence la valeur peut fausser le diagnostic. Par exemple, une grande confiance est impérative lors du comptage des cellules tumorales en circulation, qui conduisent à des métastases cancéreuses ; il peut y avoir une seule cellule tumorale pour chaque million d’autres dans un échantillon de sang. L’amélioration de la capacité à résoudre ces événements rares pourrait conduire à une détection plus précoce et à de meilleures options de traitement.
De même, des comptages imprécis de différentes populations cellulaires, telles que les cellules immunitaires, dans un échantillon peuvent conduire à un diagnostic incorrect de la maladie ou à une mauvaise interprétation du succès d’un traitement médicamenteux. Il peut être difficile de dire si différentes mesures proviennent de types de cellules distincts ou simplement d’une variabilité expérimentale.
Pour remédier à cette situation, les chercheurs du NIST ont créé et validé un nouveau système qui enregistre directement la quantité de variation dans les mesures de cytométrie en flux pour quantifier l’incertitude. Leur instrument effectue une série de lectures multiples de la même particule dont la position et la vitesse sont contrôlées avec précision lors de son déplacement dans le canal, ce qui leur permet d’observer des variations dépendant de la mesure aussi faibles que 1 %.
« C’est la première fois que nous pouvons mesurer directement l’incertitude par objet dans un cytomètre en flux », a déclaré Matthew DiSalvo, auteur principal de l’équipe du NIST qui a publié ses résultats le 20 juillet 2022 dans la revue Laboratoire sur puce. « Lorsque vous mesurez quelque chose une fois, et une seule fois, vous ne pouvez pas vérifier la précision », a-t-il déclaré. « Pour ce faire, vous avez besoin de répétabilité. »
Le nouveau cytomètre en flux série à puce résout ce problème en effectuant quatre mesures de chaque particule : deux lectures à chacun de deux points différents séparés de 16 millimètres ; (environ 0,6 pouces) dans le canal avec des débits aussi élevés que 100 particules ou plus par seconde.
Plusieurs défis critiques ont dû être surmontés pour créer le nouveau cytomètre, qui a été initialement testé à l’aide de billes de plastique uniformes d’environ 15 micromètres (µm, millionièmes de mètre) de diamètre, environ un dixième de la largeur d’un cheveu humain et de la même taille que globules blancs moyens.
L’un des défis était de fabriquer un canal (environ 40 µm sur 80 µm) incorporant deux zones identiques sur lesquelles la lumière laser était appliquée à la particule qui passait et de s’assurer que la plus grande quantité de lumière fluorescente émise était capturée par une paire de détecteurs qui mesuraient en sens amont et aval. Pour ce faire, DiSalvo et le chef de projet Gregory Cooksey ont développé des guides d’ondes avancés qui minimisent les pertes et empêchent la lumière d’émission de se propager. Cooksey possède une vaste expérience dans les conceptions pionnières de la microfluidique, et l’équipe du cytomètre s’est appuyée sur cet ensemble de travaux.
Un autre défi particulièrement exigeant consistait à trouver un moyen de s’assurer que les émissions enregistrées dans chacune des deux zones du canal provenaient de la même particule. Cela ne pouvait être fait qu’en contrôlant la position et la vitesse de la particule si exactement que le temps de transit d’un nœud à l’autre était connu avec précision, permettant au système de faire correspondre les mesures au premier nœud avec celles du second.
Pour ce faire, les chercheurs ont mis au point une technique « hybride » permettant de focaliser la particule en un point précis du canal. Dans les cytomètres conventionnels, cela se fait généralement en utilisant deux pompes à fluide différentes : une pour injecter les particules et une pour créer une gaine de fluide séparée autour du périmètre intérieur du canal, formant en fait un tube de liquide dans le canal solide. Cela agit pour confiner l’échantillon dans le noyau central du canal.
Ou, du moins, c’est la présomption. Mais en fait, a déclaré Cooksey, dans les petits canaux « c’est le pire endroit possible pour le mettre ».
La raison en est que l’inertie du fluide dans les petits canaux ajoute deux forces sur la particule. Une force agit pour éloigner la particule de la paroi. Mais une autre force éloigne la particule du centre du canal en raison de la différence de vitesse du fluide agissant de part et d’autre de la particule. En conséquence, la particule a naturellement tendance à se décentrer vers une position d’équilibre dans laquelle les forces sont équilibrées. Pour la conception spécifique utilisée dans cette étude, le déplacement de la ligne médiane varie avec la vitesse du fluide, d’environ 11 µm à 0,75 mètre par seconde à 14 µm à 1,35 m/s.
Pour contrôler cette position très précisément, DiSalvo et Cooksey ont utilisé quatre pompes pour entraîner la gaine, leur permettant d’ajuster les pressions d’un côté à l’autre ainsi que de haut en bas. « Nous utilisons l’hydrodynamique pour placer la particule à la position où nous savons qu’elle veut aller au tout début de son transit », a déclaré DiSalvo. « Ainsi, lorsqu’une particule accélère dans le canal, elle est déjà à sa position d’équilibre. C’est très étroitement maintenu sur toute la longueur du cytomètre. »
Par conséquent, l’appareil est capable d’effectuer des mesures de haute précision avec les particules se déplaçant à une vitesse élevée de 1 m/s. (1 m/s, ou environ 2,3 mph, peut sembler lent. Mais à cette vitesse, une particule de 10 µm se déplace 100 000 fois la longueur de son corps par seconde. Une automobile faisant cela se déplacerait à environ 1 million de mph.)
Depuis que les expériences ont été rapportées dans le nouvel article de la revue, l’équipe a mesuré les globules blancs dans l’appareil. « La première chose que nous avons examinée, c’est où se trouve la cellule dans son cycle de division », a déclaré Cooksey. « Nous observons la quantité d’ADN dans la cellule. Le signal fluorescent nous permet de quantifier combien de cellules sont activement en train de se diviser, en cours de synthèse d’ADN. »
Les chercheurs utilisent également différentes longueurs d’onde laser pour révéler différentes propriétés de l’échantillon.
« Nous avons considérablement modifié les guides d’ondes pour augmenter la sensibilité en incorporant des microlentilles et d’autres améliorations », a déclaré DiSalvo. « Nous pensons que nous pourrons bientôt fournir des mesures d’incertitude tout en correspondant à la sensibilité des systèmes commerciaux à mesure unique qui coûtent des centaines de milliers de dollars. »
Le projet de cytomètre comprend des collaborateurs ayant une expertise en mathématiques et en modélisation, menant à de nouvelles méthodes analytiques supplémentaires qui amélioreront la quantification et la classification. Les chercheurs du NIST, Paul Patrone et Anthony Kearsley, ont utilisé l’analyse des signaux pour séparer les variations de mesure dues aux variations de débit et à la taille des particules. Leurs méthodes permettent également une capacité inégalée d’identifier et de séparer des objets qui auraient été auparavant trop proches les uns des autres pour être distingués dans une mesure conventionnelle. Le fait de ne pas distinguer des objets séparés empêche la précision du comptage et peut entraîner l’absence de composants d’échantillon uniques, tels que des cellules tumorales en circulation ou des cellules immunitaires en interaction.
Matthew DiSalvo et al, Cytométrie en flux série dans une micropuce optofluidique à focalisation inertielle pour l’évaluation directe des variations de mesure, Laboratoire sur puce (2022). DOI : 10.1039/D1LC01169C