La modification du phosphorothioate d’ADN (PT), avec un oxygène sans pont dans le squelette phosphodiester remplacé par du soufre, est un marqueur épigénétique chez les procaryotes et est impliquée dans le système de défense bactérien, le stress antioxydant et la régulation des gènes. La modification PT est spécifiquement reconnue par les domaines de liaison au soufre (SBD) des endonucléases de restriction dépendant de la PT, ce qui en fait un outil potentiel pour permettre le développement de la biotechnologie. Cependant, la plage de séquences de reconnaissance peu claire des SBD limite l’application.
Une étude publiée dans la revue Bulletin scientifique était dirigé par le professeur Lixin Zhang (Laboratoire d’État clé d’ingénierie des bioréacteurs et École de biotechnologie, Université des sciences et technologies de Chine orientale) et le Dr Guang Liu (Laboratoire clé d’État du métabolisme microbien, Laboratoire international commun de recherche sur les sciences du métabolisme et du développement , École des sciences de la vie et de biotechnologie, Université Jiao Tong de Shanghai).
Cette étude a rapporté une technique appelée séquençage de spécificité de liaison au soufre (SBS-seq) pour la caractérisation à haute résolution de la gamme de séquences complète des SBD, et a utilisé des modifications PT en tandem pour améliorer l’affinité de liaison et étendre la gamme de séquences des SBD. La forte affinité et la large gamme ont facilité la création d’une nouvelle plateforme de détection d’acide nucléique basée sur le SBD et le PT-ADN.
Afin de profiler la spécificité de séquence complète à haute résolution des SBD, Yuting Shuai et al. développé la technique SBS-seq, qui implique quatre étapes principales : (1) la construction d’une bibliothèque d’ADN-PT aléatoire et impartiale, le caractère aléatoire de la bibliothèque d’ADN-PT construite étant confirmé par un séquençage en profondeur ; (2) sélection de liaison in vitro avec la protéine SBD ; (3) vérification du substrat lié par essai de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) ; (4) séquençage approfondi et analyse des données. Les résultats de SBS-seq ont ensuite été validés par des tests de polarisation de fluorescence (FP) et EMSA, et le mécanisme a été expliqué par des simulations de dynamique moléculaire (MD).
Ils ont également constaté que les SBD ont une efficacité de liaison plus forte sur l’ADN avec des modifications PT en tandem, et ont démontré que la conception de la modification PT en tandem élargissait davantage la gamme de séquences et améliorait l’affinité de liaison des SBD.
SBS-seq a identifié la spécificité de séquence complète à haute résolution et la conception de modification PT en tandem a encore élargi la plage de séquences et amélioré l’affinité de liaison des SBD. Sur la base de ces résultats, ils ont facilité le système de détection d’acide nucléique basé sur SBD pour la détection de l’ADNsb.
En conclusion, cette équipe a développé une technique SBS-seq basée sur le séquençage profond à haute résolution pour mesurer la spécificité de séquence complète des SBD de liaison PT-ADN, et a étendu le spectre de reconnaissance de séquence des SBD et amélioré l’affinité de liaison en ajoutant un tandem. Modifications PT dans l’ADN.
Sur la base de ces résultats, ils ont amélioré la sensibilité de détection de la plateforme de détection d’acides nucléiques basée sur SBD et PT-ADN. Leurs travaux fournissent des informations pour la recherche sur les endonucléases de restriction dépendantes de la modification et facilitent les applications biotechnologiques de la modification par PT.
Plus d’information:
Yuting Shuai et al, Le profil et l’assouplissement de la spécificité de séquence des domaines de liaison au soufre de l’ADN facilitent une nouvelle plateforme de détection d’acide nucléique, Bulletin scientifique (2023). DOI : 10.1016/j.scib.2023.07.012