Une équipe de scientifiques du Laboratoire national de Brookhaven du Département américain de l’énergie (DOE) et de l’Université de Columbia a démontré un moyen de produire de grandes quantités du récepteur auquel le SRAS-CoV-2, le virus responsable du COVID-19, se lie à la surface. de cellules humaines. Cette liaison entre la désormais tristement célèbre protéine de pointe virale et le récepteur humain « ACE2 » est la première étape de l’infection par le virus. La production de protéines ACE2 humaines fonctionnelles dans des cellules de souris offre aux scientifiques une nouvelle façon d’étudier ces récepteurs et potentiellement de les utiliser. De plus, comme décrit dans un article qui vient d’être publié dans la revue Virologiela méthode pourrait faciliter l’étude d’autres protéines complexes qui se sont révélées difficiles à produire par d’autres moyens.
L’objectif initial des scientifiques de Brookhaven, au début de la pandémie, était de fabriquer de grandes quantités d’ACE2 humain, puis de lier la protéine à des nanoparticules. Les nanoparticules recouvertes d’ACE2 pourraient ensuite être testées comme agents thérapeutiques antiviraux et/ou comme capteurs pour détecter les particules virales.
« Pour l’une ou l’autre de ces applications, vous avez besoin de grandes quantités de protéines, et la protéine doit être entièrement fonctionnelle », a déclaré Paul Freimuth, virologue au Brookhaven Lab, qui a dirigé la recherche en collaboration avec des scientifiques du Center for Functional Nanomaterials (CFN) du Brookhaven Lab. « Mais fabriquer des protéines membranaires fonctionnelles comme ACE2 est particulièrement difficile car le processus par lequel les protéines sont localisées dans la membrane cellulaire est complexe. »
L’une des raisons est que ces protéines sont modifiées de diverses manières après leur synthèse et avant leur insertion dans la membrane cellulaire. En particulier, les molécules de glucides ajoutées aux protéines jouent un rôle clé à la fois dans la manière dont la longue chaîne protéique se replie dans sa structure 3D finale et dans le fonctionnement de la protéine dans la membrane.
« Les glucides représentent environ un tiers de la masse de protéines ACE2 », a déclaré Freimuth.
Les cellules les plus simples que les scientifiques utilisent pour générer artificiellement des protéines, à savoir les bactéries, ne disposent pas des enzymes nécessaires pour fixer ces glucides supplémentaires. Ainsi, l’équipe de Brookhaven s’est tournée vers les cellules de souris qui, en tant que mammifères, nous ressemblent davantage et sont donc capables d’effectuer le même type de transformation des glucides. Les cellules de souris sont connues pour être capables de capter et d’exprimer des gènes « étrangers ». Et bien que les cellules de souris fabriquent également un récepteur ACE2, la version murine de la protéine ne se lie pas au pic du SRAS-CoV-2. Cela signifie que les scientifiques auraient un moyen simple de voir si les cellules de souris produisaient la protéine ACE2 humaine, en voyant si les pointes se lient aux cellules.
Trouver et exprimer le gène ACE2
Pour augmenter les chances que les cellules de souris incorporent et lisent correctement le gène ACE2 humain, le groupe a utilisé le gène intact. Les gènes des humains et d’autres « organismes supérieurs » contiennent de nombreuses informations en plus de la séquence d’ADN qui code les éléments constitutifs des acides aminés qui composent une protéine. Ces informations supplémentaires aident à réguler la structure et la fonction des gènes au sein des chromosomes de la cellule.
Les scientifiques ont recherché des bibliothèques de fragments d’ADN clonés générés dans le cadre du Projet du génome humain– un effort parrainé par le DOE pour cartographier l’emplacement de tous les gènes qui font de nous des humains – pour trouver un fragment contenant le gène ACE2 intact, avec ses informations réglementaires intégrées. Ensuite, ils ont exposé des cellules de souris à des nanoparticules recouvertes de ce fragment d’ADN ainsi que du gène d’une autre protéine qui rend les cellules résistantes à un antibiotique mortel.
« Dans ce cas, les nanoparticules servent d’agent de délivrance d’ADN qui est englouti par les cellules afin que l’ADN puisse potentiellement s’intégrer dans les chromosomes des cellules de souris », a déclaré Freimuth. « Pour trouver les cellules qui ont capté le(s) gène(s) étranger(s), nous ajoutons l’antibiotique aux cultures cellulaires. Les cellules qui n’ont pas réussi à absorber et à exprimer le gène de résistance aux antibiotiques sont mortes, tandis que celles qui ont acquis une résistance aux antibiotiques ont survécu et se sont développées en colonies. « .
Les scientifiques ont développé environ 50 de ces colonies en cultures individuelles, puis les ont testées pour déterminer combien avaient également détecté le gène ACE2 humain et produit la protéine réceptrice humaine.
Détection de la production de protéines
« Environ 70 % des colonies résistantes aux antibiotiques exprimaient la protéine ACE2 humaine à la surface des cellules », a déclaré Freimuth. « Une analyse plus approfondie a montré que ces colonies contenaient en moyenne 28 copies du gène ACE2 humain. »
Il est important de noter que les cellules de souris ont conservé les copies « étrangères » du gène ACE2 et ont continué à fabriquer la protéine ACE2 humaine codée par ces gènes pendant au moins 90 générations de cellules.
Le niveau de protéine ACE2 humaine produite par les cellules était généralement proportionnel au nombre de copies du gène ACE2 intégrées dans le génome de la souris. Plusieurs clones de cellules de souris ont produit environ 50 fois plus d’ACE2 que ce qui est normalement présent sur les cellules de souris.
Les scientifiques ont utilisé diverses méthodes pour vérifier si les protéines ACE2 humaines fabriquées par la souris étaient fonctionnelles. Il s’agissait notamment de démontrer qu’un « pseudovirus » contenant la protéine de pointe du COVID – c’est-à-dire un substitut non pathogène du SRAS-CoV-2 – pouvait se lier aux récepteurs et infecter les cellules.
« Ces tests d’infectiosité ont montré que la protéine ACE2 humaine exprimée sur ces cellules de souris est entièrement fonctionnelle », a déclaré Freimuth.
Utilisations et implications
Pendant ce temps, Oleg Gang et Feiyue Teng, co-auteurs de l’étude du CFN, ont exploré diverses façons de créer des nano-vésicules extracellulaires enrichies en ACE2 humain leurre pour le traitement potentiel du COVID-19. Ils étudient également le placement des protéines ACE2 sur des nanoparticules pour des applications potentielles dans le traitement des infections ou la détection rapide de virus.
« Le défi posé par les nano-vésicules basées sur ACE2 réside dans l’amélioration de leur effet neutralisant contre le SRAS-CoV-2. Nous recherchons également des moyens d’améliorer et d’exploiter la sensibilité et la spécificité de liaison des nanoparticules couplées à ACE2 pour les rendre utiles pour le virus. Les deux approches nécessiteraient de futurs efforts d’optimisation », a déclaré Teng, associé de recherche au CFN qui a beaucoup travaillé à la fois sur les aspects biologiques de cette étude et sur les applications potentielles basées sur les nanosciences.
« Nous sommes ravis de combiner les avancées dans la fabrication de nanomatériaux avec des approches biomoléculaires pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et de détection », a déclaré Gang, titulaire d’un poste conjoint à l’Université de Columbia. « Cette étude nous a permis de surmonter certains problèmes méthodologiques, car les nanomatériaux et les biosystèmes nécessitaient des approches de caractérisation très différentes. Ce que nous avons appris ici est important pour nos prochaines étapes visant à améliorer la biodétection basée sur les nanoparticules. »
En plus de permettre des applications possibles de la protéine ACE2 recombinante, les travaux démontrent également une nouvelle approche pour produire une large gamme de protéines complexes. Les exemples incluent la vaste gamme de récepteurs de surface cellulaire qui interviennent dans d’innombrables processus biologiques et pathologiques, ainsi que des protéines d’importance industrielle telles que les anticorps monoclonaux et les enzymes.
« Notre méthode consistant à utiliser des gènes intacts ainsi que des cellules de souris pouvant être adaptées pour se développer dans d’énormes cultures en suspension, tout comme les cultures en bouillon liquide utilisées pour cultiver des bactéries, pourrait faire progresser la production à grande échelle de ces protéines et d’autres protéines importantes », a déclaré Freimuth. .
Plus d’information:
Feiyue Teng et al, Surexpression de la protéine ACE2 humaine dans des fibroblastes de souris transfectés de manière stable avec le gène ACE2 intact, Virologie (2024). DOI : 10.1016/j.virol.2024.109988