Des chercheurs développent une technologie polyvalente et peu coûteuse pour le séquençage ciblé d’ARN à lecture longue

Dans un développement qui pourrait accélérer la découverte de nouveaux diagnostics et traitements, les chercheurs de l’hôpital pour enfants de Philadelphie (CHOP) ont développé une technologie polyvalente et peu coûteuse pour le séquençage ciblé de molécules d’ARN pleine longueur. La technologie, appelée TEQUILA-seq, est très rentable par rapport aux solutions disponibles dans le commerce pour le séquençage ciblé de l’ARN et peut être adaptée à différentes fins de recherche et cliniques. Les détails sont décrits dans un article de Communication Nature.

Au cours du voyage du gène à la protéine, une molécule d’ARN peut être coupée et jointe de différentes manières avant d’être traduite en une protéine. Ce processus est connu sous le nom d’épissage alternatif et permet à un seul gène de coder plusieurs protéines différentes. Bien que l’épissage alternatif se produise dans de nombreux processus biologiques, il peut être dérégulé dans des maladies comme le cancer, conduisant à des molécules d’ARN pathogènes. Pour comprendre comment l’épissage alternatif peut conduire à la maladie, les chercheurs doivent avoir une comptabilité précise de toutes les molécules d’ARN (appelées « isoformes de transcription ») qui émanent d’un seul gène.

Une façon de le faire consiste à utiliser des plates-formes de séquençage d’ARN « à lecture longue », qui séquencent des molécules d’ARN de plus de 10 000 bases de bout en bout, capturant l’intégralité des isoformes de transcription. Cependant, ces plates-formes à lecture longue ont un rendement de séquençage modeste, ce qui a entravé leur adoption généralisée, en particulier dans le cadre clinique, car la génération de données de séquençage d’ARN à lecture longue à une profondeur cliniquement informative pourrait être d’un coût prohibitif. Le séquençage ciblé, qui consiste à enrichir des séquences d’acides nucléiques spécifiques d’intérêt avant le séquençage, est une stratégie utile qui peut considérablement améliorer la couverture de cibles prédéfinies, mais le coût et la complexité de la capture de cibles ont été des obstacles à une utilisation plus large.

« Le séquençage d’ARN à lecture longue ciblée est une stratégie puissante pour élucider le répertoire d’ARN pour tout ensemble prédéfini de gènes. Cependant, les technologies existantes pour le séquençage ciblé de molécules d’ARN pleine longueur sont soit coûteuses, soit difficiles à mettre en place, les mettant hors de portée pour de nombreux laboratoires », a déclaré le co-auteur principal Lan Lin, Ph.D., professeur adjoint de pathologie et de médecine de laboratoire et membre du Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics au CHOP. « TEQUILA-seq résout ce problème en étant à la fois peu coûteux et facile à utiliser. La technologie peut être adaptée par les utilisateurs à différentes fins, et les chercheurs peuvent choisir les gènes qu’ils souhaitent séquencer et fabriquer les réactifs pour la capture de cible dans leurs propres laboratoires. a le potentiel d’accélérer la découverte de nouvelles solutions diagnostiques et thérapeutiques pour un large éventail de maladies. »

Une méthode qui permet un séquençage ciblé est appelée enrichissement basé sur la capture d’hybridation, qui utilise de courts morceaux d’acides nucléiques appelés oligonucléotides comme sondes de capture. Ces oligonucléotides (souvent simplement appelés « oligos ») sont marqués avec des molécules de biotine et conçus pour s’hybrider à leurs cibles en fonction de la complémentarité des séquences d’acides nucléiques, ce qui permet une capture et une isolation faciles de leurs séquences cibles à partir d’un échantillon biologique. Cependant, bien que l’enrichissement basé sur la capture d’hybridation soit une méthode efficace pour le séquençage ciblé, les sondes de capture biotinylées synthétisées dans le commerce sont coûteuses et ne peuvent être utilisées que pour un nombre limité de réactions, ce qui rend le coût par échantillon élevé pour chaque réaction de capture.

Pour remédier à cette limitation, les chercheurs du CHOP ont développé TEQUILA-seq (Transcript Enrichment and Quantification Utilizing Isothermally Linear-Amplified probes in conjonction avec le séquençage à lecture longue). Une innovation clé dans TEQUILA-seq est une réaction d’amplification par déplacement de brin isotherme déclenchée par une endonucléase de coupure, qui peut synthétiser de grandes quantités de sondes de capture biotinylées à partir d’un pool bon marché d’oligos non biotinylés comme matrices. En utilisant une entrée de seulement 2 ng d’oligos matrices, les chercheurs peuvent générer 25 ug de sondes TEQUILA, qui peuvent être utilisées pour au moins 250 réactions de capture. Cette stratégie innovante de synthèse des sondes de capture rend TEQUILA-seq très rentable et évolutif pour de grands panels cibles et de nombreux échantillons biologiques.

Pour comparer ses performances, les chercheurs ont effectué TEQUILA-seq pour plusieurs panels de gènes sur des ARN synthétiques ou des ARN humains. Les sondes TEQUILA ont été aussi performantes que les sondes de capture commerciales pour la capture et l’enrichissement de cibles, tout en étant des centaines de fois moins chères pour chaque réaction de capture. De plus, les chercheurs ont démontré que TEQUILA-seq peut considérablement améliorer la détection tout en préservant la quantification des molécules d’ARN cibles.

« En utilisant des réactifs bon marché et un flux de travail expérimental simple, TEQUILA-seq nous permet de séquencer en profondeur les molécules d’ARN pleine longueur pour n’importe quel ensemble de gènes dans de nombreux échantillons biologiques », a déclaré le co-auteur principal Yi Xing, Ph.D., directeur du Centre. pour la médecine computationnelle et génomique au CHOP. « C’est très excitant et permet un large éventail d’applications médicales, du diagnostic génétique guidé par l’ARN au développement de thérapies. »

Pour illustrer son utilité biomédicale, les chercheurs ont appliqué TEQUILA-seq pour profiler les molécules d’ARN pleine longueur de 468 gènes de cancer exploitables sur 40 lignées cellulaires de cancer du sein. Ils ont découvert des isoformes de transcription jusque-là inconnues dans des gènes cancéreux largement étudiés qui pourraient éclairer la façon dont les gènes qui protègent le corps contre le cancer sont inactivés dans des tumeurs individuelles.

« Notre travail montre que TEQUILA-seq peut être largement utilisé pour le séquençage ciblé de molécules d’ARN pleine longueur », a déclaré le Dr Lin. « De plus, les sondes TEQUILA sont des sondes de capture à usage général. Elles sont compatibles pour le séquençage ciblé d’ARN et d’ADN, sur les plates-formes de séquençage à lecture longue et à lecture courte. La capacité de générer facilement de grandes quantités de sondes de capture biotinylées pour n’importe quel panel cible à faible coût et avec facilité peut faciliter des études à grande échelle et au niveau de la population pour de nombreuses applications fondamentales, translationnelles et cliniques. »