Des chercheurs augmentent la sensibilité et la vitesse de la technique de microscopie Raman

Les chercheurs ont développé une approche de spectroscopie Raman sans étiquette et non invasive qui peut acquérir des images microscopiques d’échantillons biologiques et identifier une large gamme de biomolécules avec une vitesse et une sensibilité sans précédent.

« Notre travail pourrait conduire à un dispositif non invasif, sans étiquette et convivial à usage clinique », a déclaré le chef de l’équipe de recherche Dario Polli du Politecnico di Milano en Italie. « Ce microscope innovant, couplé à des algorithmes basés sur l’apprentissage en profondeur, pourrait éventuellement faciliter et accélérer le diagnostic du cancer en permettant la visualisation des constituants chimiques des tissus et cellules humains. »

Dans la revue Optique Express, les chercheurs décrivent leur nouvelle technique, basée sur la microscopie cohérente anti-stokes Raman scattering (CARS). La microscopie CARS produit des images basées sur les signatures vibrationnelles des molécules en exploitant l’interaction entre les impulsions laser ultracourtes et les échantillons biologiques.

La nouvelle approche donne accès à la région difficile à détecter du spectre vibratoire connue sous le nom de région d’empreintes digitales, qui s’étend de 400 à 1800 cm-1. Bien que de nombreux composés individuels puissent être identifiés à l’aide de leurs empreintes vibratoires dans cette région, celle-ci a tendance à produire des signaux faibles difficiles à détecter.

« Les techniques couramment utilisées dans les sciences biomédicales nécessitent souvent une coloration, qui est non seulement fastidieuse, mais peut également introduire des altérations structurelles et chimiques pouvant entraîner des artefacts ou des erreurs dans l’imagerie et le traitement des données », a déclaré Polli. « Parce que notre système peut distinguer de nombreuses espèces chimiques différentes dans les tissus biologiques sans étiquettes, il pourrait être utile pour l’imagerie des cellules vivantes et l’analyse des biopsies tissulaires. »

Taux de répétition inférieur, imagerie plus rapide

Ce nouveau travail fait partie du projet CRIMSON, qui vise à développer un dispositif d’imagerie clé en main qui utilise la spectroscopie vibrationnelle pour une classification rapide des cellules et des tissus. L’objectif du projet est de transformer l’étude de l’origine cellulaire des maladies pour permettre de nouvelles approches qui pourraient faire progresser la thérapie personnalisée.

Comme étape clé vers cet objectif, les chercheurs ont développé un microscope CARS basé sur un laser commercial qui produit des impulsions ultracourtes d’une durée d’environ 270 femtosecondes dans la gamme de longueurs d’onde du proche infrarouge. Ils ont conçu le système de microscopie pour utiliser des impulsions laser avec un taux de répétition de 2 MHz, ce qui est bien inférieur aux 40 ou 80 MHz utilisés par la plupart des autres systèmes CARS.

Ce taux de répétition inférieur réduit les dommages photothermiques à l’échantillon car il crée un délai de 0,5 microseconde entre deux impulsions consécutives. Il produit également une énergie d’impulsion et une intensité de crête plus élevées au point focal, ce qui génère un signal CARS plus fort et permet une vitesse d’acquisition plus rapide.

« L’avantage le plus important du taux de répétition inférieur est qu’il nous a permis de générer des impulsions Stokes à large bande et décalées vers le rouge qui couvrent toute la région vibratoire des empreintes digitales en utilisant la génération de supercontinuum de lumière blanche dans un cristal en vrac », a déclaré Federico Vernuccio, doctorant. au Politecnico di Milano et premier auteur de l’étude. « Par rapport à d’autres méthodes, cette approche est techniquement plus simple, plus compacte et robuste. »

L’utilisation d’une région spectrale décalée vers le rouge par rapport aux configurations standard signifie que des intensités laser plus élevées peuvent être utilisées avant l’apparition des photodommages. Les chercheurs ont également développé de nouveaux algorithmes qui combinent des approches informatiques numériques standard avec l’intelligence artificielle. Ces algorithmes récupèrent plus d’informations à partir des données acquises et les transforment en images qui permettent de distinguer facilement différentes espèces chimiques.

« Grâce à nos améliorations, le système CARS fournit des images de haute qualité à une vitesse d’acquisition de pointe », a déclaré Vernuccio. « Notre système a un temps de séjour des pixels inférieur à 1 milliseconde sans compromettre l’intégrité de l’échantillon. Cette vitesse est limitée par le taux de rafraîchissement du spectromètre. »

Sensibilité à haute vitesse

Pour tester leur système, les chercheurs ont utilisé des échantillons de référence pour comparer les spectres récupérés avec le nouveau microscope avec ceux acquis à l’aide d’une technique de spectroscopie vibrationnelle de pointe, bien que plus lente. Les deux méthodes ont montré un excellent accord, démontrant que le nouveau système pouvait fournir des spectres à des vitesses très élevées avec une bonne résolution spectrale et une bonne spécificité chimique.

Les chercheurs ont ensuite déterminé la limite de détection de leur système en acquérant les spectres CARS d’un ensemble de solutions de diméthylsulfoxyde à diverses concentrations. Le système a pu mesurer la concentration chimique avec une sensibilité sans précédent de 14,1 mmol/litre, soit environ le double de la sensibilité des autres systèmes CARS travaillant dans la région des empreintes digitales.

Ils ont également montré la capacité du système à distinguer et à localiser spatialement diverses billes de plastique transparentes de la taille d’un micron en fonction de leur signature vibratoire et ont pris des mesures à partir de tissus biologiques pour démontrer que la technique fonctionne sur des échantillons biologiques sans induire de dommages.

« Notre microscope CARS permet une imagerie sans étiquette avec une spécificité chimique à des vitesses plus élevées, rendant ainsi l’imagerie Raman des cellules vivantes plus réalisable », a déclaré Polli. « Cela pourrait permettre à notre système d’être utilisé pour analyser les interactions des cellules cancéreuses avec les cellules immunitaires ou pour caractériser comment la chimiothérapie affecte les cellules, par exemple. »

Les chercheurs travaillent maintenant à améliorer leur système en créant une gamme de longueurs d’onde encore plus large d’impulsions Stokes grâce à la génération de supercontinuum de lumière blanche. Cela améliorerait à la fois la vitesse d’imagerie et le nombre d’analytes chimiques détectables. Ils travaillent également à la commercialisation en développant des logiciels conviviaux, des sources optiques compactes et des conceptions pour un prototype commercial et un système de détection.