Décrypter un élément clé de la cellule, atome par atome

Quoi que vous fassiez, qu’il s’agisse de conduire une voiture, de faire du jogging ou même d’être paresseux, de manger des chips et de regarder la télévision sur le canapé, il y a toute une série de machines moléculaires à l’intérieur de chacune de vos cellules qui travaillent dur. Cette machinerie, bien trop petite pour être vue à l’œil nu ou même avec de nombreux microscopes, crée de l’énergie pour la cellule, fabrique ses protéines, fait des copies de son ADN, et bien plus encore.

Parmi ces pièces de machinerie, et l’une des plus complexes, se trouve ce qu’on appelle le complexe de pores nucléaires (NPC). Le NPC, composé de plus de 1 000 protéines individuelles, est un gardien incroyablement discriminant pour le noyau de la cellule, la région liée à la membrane à l’intérieur d’une cellule qui contient le matériel génétique de cette cellule. Tout ce qui entre ou sort du noyau doit passer par le PNJ sur son chemin.

Le rôle du PNJ en tant que gardien du noyau signifie qu’il est vital pour les opérations de la cellule. Dans le noyau, l’ADN, le code génétique permanent de la cellule, est copié en ARN. Cet ARN est ensuite extrait du noyau afin de pouvoir être utilisé pour fabriquer les protéines dont la cellule a besoin. Le NPC garantit que le noyau obtient les matériaux dont il a besoin pour synthétiser l’ARN, tout en protégeant l’ADN de l’environnement hostile à l’extérieur du noyau et en permettant à l’ARN de quitter le noyau après sa fabrication.

« C’est un peu comme un hangar d’avions où l’on peut réparer des 747, et la porte s’ouvre pour laisser entrer le 747, mais il y a une personne debout qui peut empêcher une seule bille de sortir pendant que les portes sont ouvertes », explique André de Caltech. Hoelz, professeur de chimie et de biochimie et chercheur à l’Institut médical Howard Hughes. Depuis plus de deux décennies, Hoelz étudie et décrypte la structure du PNJ par rapport à sa fonction. Au fil des années, il n’a cessé de percer ses secrets, les dévoilant morceau par morceau par morceau par morceau.

Les implications de cette recherche sont potentiellement énormes. Non seulement le PNJ est au cœur des opérations de la cellule, mais il est également impliqué dans de nombreuses maladies. Les mutations du NPC sont responsables de certains cancers incurables, de maladies neurodégénératives et auto-immunes telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et l’encéphalopathie nécrosante aiguë, et de maladies cardiaques telles que la fibrillation auriculaire et la mort cardiaque subite précoce. De plus, de nombreux virus, dont celui responsable du COVID-19, ciblent et arrêtent le PNJ au cours de leur cycle de vie.

Maintenant, dans une paire d’articles publiés dans la revue La scienceHoelz et son équipe de recherche décrivent deux percées importantes : la détermination de la structure de la face externe du PNJ et l’élucidation du mécanisme par lequel des protéines spéciales agissent comme une colle moléculaire pour maintenir le PNJ ensemble.

Un tout petit puzzle 3D

Dans leur article intitulé « Architecture de la face cytoplasmique du pore nucléaire », Hoelz et son équipe de recherche décrivent comment ils ont cartographié la structure du côté du PNJ qui fait face à l’extérieur du noyau et dans le cytoplasme des cellules. Pour ce faire, ils ont dû résoudre l’équivalent d’un tout petit puzzle 3D, en utilisant des techniques d’imagerie telles que la microscopie électronique et la cristallographie aux rayons X sur chaque pièce du puzzle.

Stefan Petrovic, étudiant diplômé en biochimie et biophysique moléculaire et l’un des co-premiers auteurs des articles, explique que le processus a commencé avec la bactérie Escherichia coli (une souche de bactérie couramment utilisée dans les laboratoires) qui a été génétiquement modifiée pour produire les protéines qui composent le PNJ humain.

« Si vous entrez dans le laboratoire, vous pouvez voir ce mur géant de flacons dans lequel les cultures se développent », explique Petrovic. « Nous exprimons chaque protéine individuelle dans les cellules d’E. coli, ouvrons ces cellules et purifions chimiquement chaque composant protéique. »

Une fois cette purification – qui peut nécessiter jusqu’à 1 500 litres de culture bactérienne pour obtenir suffisamment de matériel pour une seule expérience – terminée, l’équipe de recherche a commencé à tester minutieusement comment les pièces du PNJ s’emboîtaient.

George Mobbs, chercheur postdoctoral senior en chimie et autre co-premier auteur de l’article, affirme que l’assemblage s’est déroulé de manière « par étapes » ; plutôt que de verser toutes les protéines ensemble dans un tube à essai en même temps, les chercheurs ont testé des paires de protéines pour voir lesquelles s’emboîteraient, comme deux pièces de puzzle. Si une paire était trouvée qui s’emboîtait, les chercheurs testaient alors les deux protéines maintenant combinées contre une troisième protéine jusqu’à ce qu’ils en trouvent une qui corresponde à cette paire, puis la structure en trois parties résultante était testée contre d’autres protéines, et ainsi sur. Se frayer un chemin à travers les protéines de cette manière a finalement produit le résultat final de leur article : un coin de 16 protéines qui est répété huit fois, comme des tranches de pizza, pour former le visage du PNJ.

« Nous avons rapporté la première structure complète de la face cytoplasmique entière du PNJ humain, ainsi qu’une validation rigoureuse, au lieu de rapporter une série d’avancées incrémentielles de fragments ou de portions basées sur une observation partielle, incomplète ou à faible résolution », déclare Si Nie , chercheur postdoctoral associé en chimie et également co-premier auteur de l’article. « Nous avons décidé d’attendre patiemment jusqu’à ce que nous ayons acquis toutes les données nécessaires, rapportant une énorme quantité de nouvelles informations. »

Leurs travaux ont complété les recherches menées par Martin Beck de l’Institut Max Planck de biophysique de Francfort, en Allemagne, dont l’équipe a utilisé la tomographie cryo-électronique pour générer une carte fournissant les contours d’un puzzle dans lequel les chercheurs devaient placer les pièces. Pour accélérer l’achèvement du puzzle de la structure du PNJ humain, Hoelz et Beck ont ​​échangé des données il y a plus de deux ans, puis ont construit indépendamment des structures de l’ensemble du PNJ. « La carte de Beck considérablement améliorée montrait beaucoup plus clairement où chaque pièce du PNJ – pour laquelle nous avons déterminé les structures atomiques – devait être placée, comme un cadre en bois qui définit le bord d’un puzzle », explique Hoelz.

Les structures déterminées expérimentalement des pièces NPC du groupe Hoelz ont servi à valider la modélisation par le groupe Beck. « Nous avons placé les structures sur la carte de manière indépendante, en utilisant différentes approches, mais les résultats finaux étaient tout à fait d’accord. C’était très satisfaisant de voir cela », déclare Petrovic.

« Nous avons construit un cadre sur lequel de nombreuses expériences peuvent désormais être réalisées », déclare Christopher Bley, chercheur postdoctoral senior en chimie et également co-premier auteur. « Nous avons maintenant cette structure composite, et elle permet et informe de futures expériences sur la fonction des PNJ, ou même sur les maladies. Il y a beaucoup de mutations dans les PNJ qui sont associées à de terribles maladies, et savoir où elles se trouvent dans la structure et comment elles se réunir peut aider à concevoir la prochaine série d’expériences pour essayer de répondre aux questions de ce que font ces mutations. »

« Cet arrangement élégant de nouilles spaghetti »

Dans l’autre article, intitulé « Architecture de l’échafaudage de liaison dans le pore nucléaire », l’équipe de recherche décrit comment elle a déterminé la structure entière de ce que l’on appelle l’échafaudage de liaison du PNJ – la collection de protéines qui aident à maintenir le PNJ ensemble. tout en lui offrant la flexibilité dont il a besoin pour s’ouvrir et se fermer et s’adapter aux molécules qui le traversent.

Hoelz compare le PNJ à quelque chose construit à partir de briques Lego qui s’emboîtent sans se verrouiller ensemble et sont à la place attachés ensemble par des élastiques qui les maintiennent principalement en place tout en leur permettant de se déplacer un peu.

« J’appelle ces morceaux de colle non structurés la » matière noire du pore «  », explique Hoelz. « Cet élégant arrangement de nouilles spaghetti maintient le tout ensemble. »

Le processus de caractérisation de la structure de l’échafaudage de liaison était sensiblement le même que le processus utilisé pour caractériser les autres parties du NPC. L’équipe a fabriqué et purifié de grandes quantités des nombreux types de protéines de liaison et d’échafaudage, a utilisé une variété d’expériences biochimiques et de techniques d’imagerie pour examiner les interactions individuelles et les a testées pièce par pièce pour voir comment elles s’emboîtent dans le PNJ intact.

Pour vérifier leur travail, ils ont introduit des mutations dans les gènes qui codent pour chacune de ces protéines de liaison dans une cellule vivante. Puisqu’ils savaient comment ces mutations modifieraient les propriétés chimiques et la forme d’une protéine de liaison spécifique, la rendant défectueuse, ils pouvaient prédire ce qui arriverait à la structure des PNJ de la cellule lorsque ces protéines défectueuses seraient introduites. Si les PNJ de la cellule étaient fonctionnellement et structurellement défectueux comme ils s’y attendaient, ils savaient qu’ils avaient l’arrangement correct des protéines de liaison.

« Une cellule est beaucoup plus compliquée que le simple système que nous créons dans un tube à essai, il est donc nécessaire de vérifier que les résultats obtenus à partir d’expériences in vitro tiennent in vivo », explique Petrovic.

L’assemblage de la face externe du PNJ a également aidé à résoudre un mystère de longue date sur l’enveloppe nucléaire, le système à double membrane qui entoure le noyau. Comme la membrane de la cellule dans laquelle réside le noyau, la membrane nucléaire n’est pas parfaitement lisse. Au contraire, il est parsemé de molécules appelées protéines membranaires intégrales (IMP) qui remplissent divers rôles, notamment en tant que récepteurs et en aidant à catalyser les réactions biochimiques.

Bien que les IMP puissent être trouvés à la fois sur les côtés intérieurs et extérieurs de l’enveloppe nucléaire, il n’était pas clair comment ils se déplaçaient réellement d’un côté à l’autre. En effet, parce que les IMP sont coincés à l’intérieur de la membrane, ils ne peuvent pas simplement glisser à travers le canal de transport central du NPC comme le font les molécules flottantes.

Une fois que l’équipe de Hoelz a compris la structure de l’échafaudage de liaison du PNJ, ils ont réalisé qu’il permettait la formation de petites « gouttières » autour de son bord extérieur qui permettent aux IMP de passer devant le PNJ d’un côté de l’enveloppe nucléaire à l’autre tout en restant toujours intégré dans la membrane elle-même.

« Cela explique beaucoup de choses qui ont été énigmatiques sur le terrain. Je suis très heureux de voir que le canal de transport central a effectivement la capacité de se dilater et de former des portes latérales pour ces IMP, comme nous l’avions initialement proposé il y a plus d’une décennie. « , dit Hoelz.

Pris ensemble, les résultats des deux articles représentent un bond en avant dans la compréhension des scientifiques sur la façon dont le PNJ humain est construit et comment il fonctionne. Les découvertes de l’équipe ouvrent la porte à beaucoup plus de recherches. « Après avoir déterminé sa structure, nous pouvons maintenant nous concentrer sur l’élaboration des bases moléculaires des fonctions du PNJ, telles que la façon dont l’ARNm est exporté et les causes sous-jacentes des nombreuses maladies associées au PNJ dans le but de développer de nouvelles thérapies », dit Hoelz.

Les articles décrivant les travaux paraissent dans le numéro du 10 juin de la revue La science.