De nouvelles méthodes éclairent les membranes lipidiques et permettent une cartographie des protéines à haute résolution

En biologie, la vue peut conduire à la compréhension, et les chercheurs du laboratoire du professeur Edward Boyden au McGovern Institute for Brain Research se sont engagés à mettre la vie à un objectif plus net. Avec une paire de nouvelles méthodes, ils élargissent les capacités de la microscopie d’expansion – une technique d’imagerie à haute résolution que le groupe a introduite en 2015 – donc les chercheurs du monde entier peuvent en voir plus lorsqu’ils regardent les cellules et les tissus au microscope optique.

« Nous voulons tout voir, donc nous essayons toujours de l’améliorer », explique Boyden, professeur Y. Eva Tan en neurotechnologie au MIT. « Un instantané de toute vie, jusqu’à ses éléments de construction fondamentaux, est vraiment l’objectif. » Boyden est également un enquêteur de Howard Hughes Medical Institute et membre du Yang Tan Collective au MIT.

Avec de nouvelles façons de coller leurs échantillons et de traiter les images, les utilisateurs de la microscopie d’expansion peuvent désormais voir des contours vifs des formes des cellules dans leurs images et identifier les emplacements de nombreuses protéines différentes dans un échantillon de tissu unique avec une résolution qui dépasse de loin celle de la microscopie optique conventionnelle. Ces avancées, toutes deux signalées sous forme libre dans le journal Communications de la naturepermettre de nouvelles façons de traçager les projections minces des neurones et de visualiser les relations spatiales entre les molécules qui contribuent à la santé et aux maladies.

La microscopie d’expansion utilise un hydrogel absorbant l’eau pour étendre physiquement les tissus biologiques. Une fois qu’un échantillon de tissu a été imprégné par l’hydrogel, il est hydraté. L’hydrogel gonfle alors qu’il absorbe l’eau, préservant les emplacements relatifs des molécules dans le tissu car il les éloigne doucement les uns des autres.

En conséquence, les composants cellulaires surpeuplés semblent séparés et distincts lorsque le tissu élargi est vu au microscope optique. L’approche, qui peut être réalisée à l’aide d’un équipement de laboratoire standard, a rendu l’imagerie de super-résolution accessible à la plupart des équipes de recherche.

Depuis le développement de la microscopie d’expansion pour la première fois, Boyden et son équipe ont continué d’améliorer la méthode – augmentant sa résolution, simplifiant la procédure, conduisant de nouvelles fonctionnalités et l’intégrant à d’autres outils.

Visualiser les membranes cellulaires

L’une des dernières avancées de l’équipe est une méthode appelée Microscopie à expansion à la membrane ultrastructurale (UMEXM), qu’ils décrit dans le numéro du 12 février de Communications de la nature.

Avec lui, les biologistes peuvent utiliser la microscopie d’expansion pour visualiser les membranes minces qui forment les limites des cellules et enfermer les organites à l’intérieur. Ces membranes, construites principalement de molécules appelées lipides, ont été notoirement difficiles à étiqueter densément dans des tissus intacts pour l’imagerie avec microscopie optique. Désormais, les chercheurs peuvent utiliser l’UMEXM pour étudier l’ultrastructure cellulaire et l’organisation au sein des tissus.

Tay Shin SM ’20, Ph.D. ’23, un ancien étudiant diplômé du laboratoire de Boyden et un boursier J. Douglas Tan au Tan-Yang Center for Autism Research au MIT, a dirigé le développement de l’UMEXM. « Notre objectif était très simple au début: étiquetons les membranes dans des tissus intacts, un peu comme la façon dont un microscope électronique utilise le tétroxyde d’osmium pour marquer les membranes pour visualiser les membranes dans les tissus », dit-il. « Il s’avère qu’il est extrêmement difficile d’y parvenir. »

L’équipe devait d’abord concevoir une étiquette qui rendrait les membranes dans des échantillons de tissus visibles au microscope optique. « Nous avons presque dû repartir de zéro », explique Shin. « Nous devions vraiment réfléchir aux caractéristiques fondamentales de la sonde qui allait étiqueter la membrane plasmique, puis réfléchir à la façon de les intégrer dans la microscopie d’expansion. » Cela signifiait l’ingénierie d’une molécule qui s’associerait aux lipides qui composent la membrane et le lient à la fois à l’hydrogel utilisé pour agrandir l’échantillon de tissu et une molécule fluorescente pour la visibilité.

Après avoir optimisé le protocole de microscopie d’extension pour la visualisation de la membrane et testé et améliorant les sondes potentielles, Shin a réussi une nuit tard dans le laboratoire. Il a placé un échantillon de tissu élargi sur un microscope et a vu des contours nets des cellules.

En raison de la haute résolution activée par l’expansion, la méthode a permis à l’équipe de Boyden d’identifier même les minuscules dendrites qui dépassent des neurones et de voir clairement les longues extensions de leurs axones minces. Ce genre de clarté pourrait aider les chercheurs à suivre les voies des neurones individuels dans les réseaux densément interconnectés du cerveau, selon les chercheurs.

Boyden appelle le traçage de ces processus neuronaux « une priorité absolue de notre temps dans la science du cerveau ». Un tel traçage s’appuyait traditionnellement sur la microscopie électronique, qui nécessite des compétences spécialisées et un équipement coûteux. Shin dit que parce que la microscopie d’expansion utilise un microscope optique standard, il est beaucoup plus accessible aux laboratoires du monde entier.

Shin et Boyden soulignent que les utilisateurs de la microscopie d’expansion peuvent en savoir plus sur leurs échantillons lorsqu’ils associent la nouvelle capacité à révéler des membranes lipidiques avec des étiquettes fluorescentes qui montrent où se trouvent des protéines spécifiques. « C’est important, car les protéines font une grande partie du travail de la cellule, mais vous voulez savoir où ils se trouvent en ce qui concerne la structure de la cellule », explique Boyden.

Un échantillon, de nombreuses protéines

À cette fin, les chercheurs n’ont plus à choisir quelques protéines pour voir lorsqu’ils utilisent la microscopie d’expansion. Avec une nouvelle méthode appelée expansion multiplexée Revuling (MULTIEXR), les utilisateurs peuvent désormais étiqueter et voir plus de 20 protéines différentes dans un seul échantillon. Les biologistes peuvent utiliser la méthode pour visualiser des ensembles de protéines, voir comment ils sont organisés les uns par rapport aux autres et générer de nouvelles hypothèses sur la façon dont ils pourraient interagir.

Une clé de cette nouvelle méthode, signalé 9 novembre 2024, dans Communications de la natureest la capacité de relier à plusieurs reprises les anticorps marqués par fluorescence avec des protéines spécifiques dans un échantillon de tissu élargi, de les images, puis de les dépouiller et d’utiliser un nouvel ensemble d’anticorps pour révéler un nouvel ensemble de protéines. Le Jinyoung Kang postdoct a affiné chaque étape de ce processus, assurant que les échantillons de tissus sont restés intacts et les protéines marquées ont produit des signaux brillants dans chaque cycle d’imagerie.

Après avoir capturé de nombreuses images d’un seul échantillon, l’équipe de Boyden a fait face à un autre défi: comment s’assurer que ces images étaient parfaitement alignées afin qu’elles puissent être superposées les unes aux autres, produisant une image finale qui montrait les positions précises de toutes les protéines qui avaient été étiquetées et visualisées une par une.

La microscopie d’expansion permet aux biologistes de visualiser certaines des plus petites caractéristiques de cellules, mais pour trouver les mêmes caractéristiques encore et encore pendant plusieurs cycles d’imagerie, l’équipe de Boyden a d’abord besoin de rentrer dans une structure plus grande. « Ces domaines de vue sont vraiment minuscules, et vous essayez de trouver ce champ de vision vraiment minuscule dans un gel qui est en fait devenu assez grand une fois que vous l’avez étendu », explique Margaret Schroeder, étudiante diplômée du laboratoire de Boyden qui, avec Kang, a dirigé le développement de Multexr.

Pour naviguer vers le bon endroit à chaque fois, l’équipe a décidé d’étiqueter les vaisseaux sanguins qui traversent chaque échantillon de tissu et de les utiliser comme guide. Pour permettre un alignement précis, certains détails fins devaient également apparaître de manière cohérente dans chaque image; Pour cela, l’équipe a marqué plusieurs protéines structurelles. Avec ces points de référence et un logiciel de traitement d’imagerie personnalisé, l’équipe a pu intégrer toutes leurs images d’un échantillon en une seule, révélant comment les protéines qui avaient été visualisées séparément ont été organisées les unes aux autres.

L’équipe a utilisé MultiexR pour regarder les plaques amyloïdes – les grappes de protéines aberrantes qui se développent notoirement dans le cerveau affecté par la maladie d’Alzheimer. « Nous pourrions regarder à l’intérieur de ces plaques amyloïdes et demander, ce qu’il y a à l’intérieur? Et parce que nous pouvons tacher de nombreuses protéines différentes, nous pourrions faire une exploration à haut débit », dit Boyden. L’équipe a choisi 23 protéines différentes à voir dans leurs images. L’approche a révélé certaines surprises, telles que la présence de certains récepteurs des neurotransmetteurs (AMPAR).

« Voici l’un des récepteurs les plus célèbres de toutes les neurosciences, et il y en a, se cache dans l’une des caractéristiques moléculaires les plus célèbres de la pathologie des neurosciences », explique Boyden. On ne sait pas quel rôle, le cas échéant, les récepteurs jouent dans la maladie d’Alzheimer, mais la découverte illustre comment la capacité de voir davantage de cellules à l’intérieur peut exposer des aspects inattendus de la biologie et soulever de nouvelles questions pour la recherche.

Cette histoire est republiée avec l’aimable autorisation de MIT News (web.mit.edu/newsoffice/), un site populaire qui couvre les nouvelles de la recherche, de l’innovation et de l’enseignement du MIT.