Le monde de la microscopie à balayage laser évolue rapidement, grâce à l’avènement de réseaux de détecteurs rapides et compacts. Ces réseaux remplacent le détecteur à élément unique typique des microscopes confocaux à balayage laser traditionnels, permettant ainsi des fonctionnalités nouvelles et uniques.
Alors que les détecteurs conventionnels fournissent uniquement la valeur d’intensité de la lumière collectée, un détecteur pixellisé permet également d’enregistrer la distribution spatiale de la lumière incidente, créant ainsi une petite image de la zone éclairée pour chaque point de balayage.
Les informations spatiales supplémentaires fournies par les réseaux de détecteurs permettent une technique de super-résolution connue sous le nom de microscopie à balayage d’images (ISM). ISM construit par calcul une image unique à partir d’un ensemble de données multidimensionnelles brutes produites par un microscope. L’image finale est construite avec un meilleur rapport signal/bruit (SNR), une meilleure section optique et une meilleure résolution spatiale que celles d’un microscope confocal traditionnel.
Dans le détail, la résolution latérale de l’image ISM peut dépasser la limite d’Abbe jusqu’à un facteur deux. Ces avantages sont toutefois obtenus en exploitant uniquement les informations spatiales ; la bioimagerie moderne par fluorescence peut être encore enrichie par une acquisition résolue dans le temps, qui permet d’accéder à des informations structurelles et fonctionnelles codées dans la dynamique de fluorescence (par exemple, durée de vie de la fluorescence).
Récemment, des chercheurs de l’Institut italien de technologie (IIT) de Gênes ont développé un microscope ISM compact et efficace équipé d’un détecteur à réseau de diodes à avalanche à photon unique (SPAD) capable de fournir une imagerie structurelle et fonctionnelle haute résolution dans une seule architecture. La recherche est Publié dans Photonique avancée.
Le détecteur réseau SPAD rapporté comprend 25 diodes indépendantes disposées dans une grille carrée. La petite taille et la lecture asynchrone permettent une détection rapide des photons de fluorescence incidente. Le schéma d’acquisition de données, basé sur la méthode du domaine de fréquence numérique (DFD), est une technique d’échantillonnage hétérodyne qui permet la construction de l’histogramme de décroissance de fluorescence avec une résolution temporelle allant jusqu’à 400 ps, adaptée à la plupart des applications d’imagerie de fluorescence.
La technique est suffisamment simple pour permettre le calcul de l’histogramme sur la même carte FPGA (Field-Programmable-Gate-Array) utilisée pour contrôler le microscope et enregistrer le signal détecté, simplifiant ainsi l’architecture du microscope.
Grâce aux informations spatiales et temporelles uniques fournies par le détecteur réseau SPAD, les auteurs ont démontré la combinaison des mesures de durée de vie de fluorescence (FL) avec l’ISM (FLISM). En plus des avantages ISM conventionnels, le SNR amélioré des images FLISM permet une estimation plus robuste de la durée de vie de la fluorescence.
Le rapport met en lumière la polyvalence du microscope en combinant les mesures ISM et résolues dans le temps avec la microscopie à émission stimulée (STED), en utilisant la technique de séparation par réglage de la durée de vie (SPLIT). Le résultat est une image avec une résolution latérale et un contraste améliorés obtenus sans modifier le schéma d’acquisition. De plus, les mesures résolues dans le temps permettent l’imagerie de plusieurs espèces avec un seul détecteur pour une spécificité structurelle accrue.
Le système peut distinguer différents colorants avec leurs valeurs de durée de vie de fluorescence, grâce à la représentation phaseuse de la dynamique de fluorescence. Même en utilisant des colorants ayant des valeurs de durée de vie similaires et des spectres d’excitation qui se chevauchent, il peut distinguer les différents fluorophores à l’aide de la technique d’excitation par entrelacement pulsé.
En effet, en alternant des impulsions d’excitation de laser de différentes couleurs, l’information spectrale est effectivement codée dans la dimension temporelle. Grâce à l’excellente résolution temporelle du microscope proposé, la contribution des deux colorants fluorescents peut ensuite être séparée pour éviter la diaphonie.
Selon Giuseppe Vicidomini, chercheur principal au laboratoire de microscopie et spectroscopie moléculaire de l’IIT et auteur correspondant, « les résultats de ce travail suggèrent que l’avenir de la microscopie à balayage laser est étroitement lié aux détecteurs à réseau SPAD, capables d’enrichir l’ensemble de données de microscopie avec des données supplémentaires. informations spatiales et temporelles sans qu’il soit nécessaire de modifier l’architecture optique d’un microscope confocal.
Les travaux démontrent que les détecteurs à réseau SPAD combinés à un système d’acquisition sur mesure rendent l’ISM résolu en photons facilement accessible et utilisable.
Plus d’information:
Giorgio Tortarolo et al, Microscope à balayage d’images compact et efficace à résolution de photons, Photonique avancée (2024). DOI : 10.1117/1.AP.6.1.016003