Les acides ribonucléiques circulaires (circARN) sont une plate-forme prometteuse pour les études d’expression génique en tant qu’acide ribonucléique stable et répandu dans les cellules eucaryotes, qui résultent du rétro-épissage. Dans un nouveau rapport maintenant publié dans Biotechnologie naturelle, Robert Chen et une équipe de chercheurs interdisciplinaires de l’Université de Stanford, Californie, États-Unis, ont développé une approche systématique pour assembler et tester rapidement les caractéristiques affectant la production de protéines à partir d’ARN circulaires synthétiques. L’équipe a maximisé la traduction du circRNA en optimisant les éléments fins pour mettre en œuvre des principes de conception afin d’améliorer le rendement d’ARN circulaire de plusieurs centaines de fois. Les résultats ont facilité une traduction accrue de l’ARN d’intérêt, par rapport aux niveaux d’ARN messager (ARNm), pour fournir une traduction durable in vivo.
Développement d’ARN circulaire (circARN) en laboratoire
Les thérapeutiques basées sur les acides ribonucléiques couvrent ARN messager (ARNm), petits ARN interférents (ARNsi) et microARN (miARN) avec une expansion dans la médecine moderne, y compris les petites molécules, les produits biologiques et la thérapeutique cellulaire. Par exemple, les vaccins à ARNm récemment populaires peuvent être conçus en laboratoire et développés à un rythme rapide pour répondre à l’évolution et à la crises médicales urgentes. Les ARN codants peuvent être circularisés en circARN pour prolonger la durée de la traduction des protéines, sur la base de molécules d’ARN qui covalent rejoindre tête-bêche. Bioingénieurs ont également avancé la synthèse de longs transcrits circulaires en circARN. Cependant, les mécanismes fondamentaux d’initiation de la traduction pour former un ARN circulaire ou un ARN messager diffèrent en raison de l’absence d’un Bouchon de 7-méthylguanylate (M7G) sur les ARN circulaires. En conséquence, les chercheurs doivent examiner en profondeur les principes de la traduction circulaire de l’ARN pour élaborer de meilleures thérapies et potentiellement dépasser les capacités de traduction de l’ARNm. Pour examiner cet aspect, l’équipe a développé une plate-forme modulaire à haut débit pour construire et tester des ARN circulaires synthétiques pour une traduction optimisée et des rendements protéiques améliorés.
Une plateforme d’assemblage de circARN modulaire
Les scientifiques ont développé une plateforme de clonage modulaire constituée d’un ensemble de pièces compatibles avec Porte dorée et Clonage Gibson pour permettre des tests à plus haut débit des circARN. À l’aide de la plate-forme, ils ont déterminé comment des aspects spécifiques de la conception d’ARN circulaire affectaient sa traduction. Par exemple, l’équipe avait précédemment montré comment les réponses immunitaires déclenchées par l’ARN circulaire peuvent être évitées in vivo en modifier les molécules avec m6A. Cependant, les chercheurs doivent encore comprendre l’impact de cette étape sur la traduction circulaire de l’ARN. Pour résoudre ce problème, Chen et l’équipe ont utilisé leur plate-forme de clonage et incorporé m6A. Par rapport aux circARN non modifiés, ceux contenant 5 % de m6A ont montré une traduction égale après transfection ou électroporation in vitro. Les scientifiques ont ainsi mesuré expérimentalement l’impact de la modification sur la stabilité circulaire de l’ARN.
Découvrir la dynamique du circRNA pour de solides résultats de traduction
Pour découvrir les principes sous-jacents à la topologie des vecteurs circARN nécessaires à une traduction forte, les chercheurs ont commencé à synthétiser des circARN pour générer des variants avec des peptides codés par le processus. Sur la base des résultats, l’équipe a montré que l’augmentation de la longueur de l’espaceur n’était pas bénéfique pour la traduction. Ensuite, ils ont montré comment les régions non traduites 5′ et 3′ pouvaient améliorer la traduction des circARN. Les chercheurs ont également mené une série d’expériences pour examiner l’optimisation des circARN, puis les ont comparées en une seule expérience. Ils ont montré comment les changements augmentaient progressivement l’expression de circRNA sans compromettre le rendement en ARN ou l’efficacité de la circularisation. Ils ont également montré comment la cinétique de la traduction du circRNA et de l’ARNm différait considérablement, où le circRNA prenait plus de 24 heures pour atteindre sa longueur de traduction maximale, dépassant de loin la durée de traduction de l’ARNm. Ils ont ensuite combiné la série d’optimisations de circRNA pour tester leur expression in vivo. Pour délivrer les ARN, l’équipe les a formulés avec transporteurs libérables modifiant la charge (CART) ou des molécules cationiques médiant l’expression d’ARNm dans des modèles murins. Les résultats ont montré comment les circARN modifiés pouvaient être exprimés à des forces similaires aux ARN modifiés in vivo, mais avec une durée plus longue.
Perspectives
De cette façon, Robert Chen et ses collègues ont montré comment la circularisation de l’ARN a un grand potentiel pour transformer les médicaments à base d’ARN en prolongeant la durabilité de molécules relativement hautement transitoires. Compte tenu des différences fondamentales entre les mécanismes de traduction des circARN et des ARNm, les connaissances existantes sur la maximisation de la traduction des ARNm ne se sont pas nécessairement traduites en circARN. Pour faciliter cette étude, l’équipe a créé une plate-forme de clonage modulaire de circRNA pour tester de nombreuses variations de séquence et optimisations de plusieurs paramètres. À l’aide de la plate-forme, ils ont identifié plusieurs approches pour améliorer la traduction des protéines à partir des circARN, avec des applications pour concevoir à grande échelle les ARN, produire plus de protéines que les ARNm in vitro et présenter une plus grande durabilité de sa traduction in vivo et in vitro. Les scientifiques ont systématiquement disséqué les éléments régulant la traduction des circRNA pour ensuite optimiser les régions d’intérêt pour des rendements accrus en protéines circRNA pour une production de protéines durable in vivo.
Robert Chen et al, ARN circulaire d’ingénierie pour la production améliorée de protéines, Biotechnologie naturelle (2022). DOI : 10.1038/s41587-022-01393-0
Chang-you Chen et al, Initiation de la synthèse des protéines par l’appareil de traduction eucaryote sur les ARN circulaires, La science (2006). DOI : 10.1126/science.7536344
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