Des vues sans précédent de l’intérieur des cellules et d’autres structures à l’échelle nanométrique sont désormais possibles grâce aux innovations de la microscopie par expansion. Les progrès pourraient aider à fournir un aperçu futur des neurosciences, de la pathologie et de nombreux autres domaines biologiques et médicaux.
Dans l’article « Magnify est une stratégie d’ancrage moléculaire universelle pour la microscopie d’expansion », publié le 2 janvier dans la revue Biotechnologie naturelledes collaborateurs de l’Université Carnegie Mellon, de l’Université de Pittsburgh et de l’Université Brown décrivent de nouveaux protocoles pour Magnify.
« Magnify peut être un outil puissant et accessible pour la communauté biotechnologique », a déclaré Yongxin (Leon) Zhao, professeur associé de développement de carrière de la famille Eberly en sciences biologiques.
Le laboratoire de biophotonique de Zhao est un chef de file dans le domaine de l’imagerie à super-résolution d’échantillons biologiques grâce à l’expansion physique d’échantillons dans un processus connu sous le nom de microscopie d’expansion. Tout au long du processus, les échantillons sont intégrés dans un hydrogel gonflable qui se dilate de manière homogène pour augmenter la distance entre les molécules, ce qui leur permet d’être observés avec une plus grande résolution. Cela permet de voir des structures biologiques à l’échelle nanométrique qui auparavant ne pouvaient être visualisées qu’à l’aide de techniques d’imagerie haute résolution coûteuses avec des outils de microscopie standard.
Magnify est une variante de la microscopie d’expansion qui permet aux chercheurs d’utiliser une nouvelle formule d’hydrogel, inventée par l’équipe de Zhao, qui conserve un spectre de biomolécules, offre une application plus large à une variété de tissus et augmente le taux d’expansion jusqu’à 11 fois linéairement ou ~1 300 plis du volume original.
Une vidéo montre des cellules rénales. La microscopie d’expansion (ExM) fournit des vues sans précédent de l’intérieur des cellules. La technique émergente d’imagerie à super-résolution repose sur un grossissement physique plutôt qu’optique. Les progrès du laboratoire de biophotonique Zhao de la CMU augmentent le taux d’expansion et permettent de visualiser de nombreux types de tissus en 3D. Crédit : Université Carnegie Mellon
« Nous avons surmonté certains des défis de longue date de la microscopie d’expansion », a déclaré Zhao. « L’un des principaux arguments de vente de Magnify est la stratégie universelle consistant à conserver les biomolécules du tissu, y compris les protéines, les extraits de noyau et les glucides, dans l’échantillon élargi. »
Zhao a déclaré qu’il était important de garder différents composants biologiques intacts, car les protocoles précédents nécessitaient l’élimination de nombreuses biomolécules diverses qui maintenaient les tissus ensemble. Mais ces molécules pourraient contenir des informations précieuses pour les chercheurs.
« Dans le passé, pour rendre les cellules vraiment expansibles, vous deviez utiliser des enzymes pour digérer les protéines, donc à la fin, vous aviez un gel vide avec des étiquettes qui indiquent l’emplacement de la protéine d’intérêt », a-t-il déclaré. Avec la nouvelle méthode, les molécules sont conservées intactes et plusieurs types de biomolécules peuvent être marqués dans un seul échantillon.
« Avant, c’était comme avoir des questions à choix unique. Si vous voulez étiqueter les protéines, ce serait la version 1 du protocole. Si vous voulez étiqueter les noyaux, ce serait une version différente », a déclaré Zhao. « Si vous vouliez faire de l’imagerie simultanée, c’était difficile. Désormais, avec Magnify, vous pouvez choisir plusieurs éléments à étiqueter, tels que des protéines, des lipides et des glucides, et les imager ensemble. »
Les chercheurs du laboratoire Aleksandra Klimas, chercheuse postdoctorale et Brendan Gallagher, doctorant, ont été les premiers co-auteurs de l’article.
« Il s’agit d’un moyen accessible d’imager des spécimens en haute résolution », a déclaré Klimas. « Traditionnellement, vous avez besoin d’un équipement coûteux, de réactifs et d’une formation spécifiques. Cependant, cette méthode est largement applicable à de nombreux types de préparations d’échantillons et peut être visualisée avec des microscopes standard que vous auriez dans un laboratoire de biologie. »
Gallagher, qui a une formation en neurosciences, a déclaré que son objectif était de rendre les protocoles aussi compatibles que possible pour les chercheurs qui pourraient bénéficier de l’adoption du Magnify dans le cadre de leurs trousses à outils.
« L’un des concepts clés que nous avons essayé de garder à l’esprit était de rencontrer les chercheurs là où ils se trouvent et de leur faire changer le moins de choses possible dans leurs protocoles », a déclaré Gallagher. « Cela fonctionne avec différents types de tissus, méthodes de fixation et même des tissus qui ont été conservés et stockés. Il est très flexible, en ce sens que vous n’avez pas nécessairement besoin de repenser complètement les expériences avec Magnify à l’esprit ; cela fonctionnera avec ce que vous avez déjà . »
Pour des chercheurs tels que Simon Watkins, fondateur et directeur du Centre d’imagerie biologique de l’Université de Pittsburgh et du Pittsburgh Cancer Institute, le fait que le nouveau protocole soit compatible avec un large éventail de types de tissus, y compris des coupes de tissus préservés, est important. Par exemple, la plupart des méthodes de microscopie d’expansion sont optimisées pour le tissu cérébral. En revanche, Magnify a été testé sur des échantillons provenant de divers organes humains et des tumeurs correspondantes, notamment du sein, du cerveau et du côlon.
« Disons que vous avez un tissu avec des composants denses et non denses, cela contourne des tissus qui auparavant ne se dilataient pas de manière isométrique », a déclaré Watkins. « Leon a travaillé dur pour que ce protocole fonctionne avec des tissus qui ont été archivés. »
Xi (Charlie) Ren, professeur adjoint de génie biomédical à Carnegie Mellon, étudie le tissu pulmonaire et comment modéliser sa morphogenèse et sa pathogenèse. Une partie de sa recherche consiste à rechercher les cils mobiles qui fonctionnent pour éliminer le mucus dans les voies respiratoires humaines. Avec 200 nanomètres de diamètre et seulement quelques micromètres de longueur, les structures sont trop petites pour être vues sans une technologie chronophage telle que la microscopie électronique. En collaboration avec le laboratoire de Zhao, l’équipe de Ren a développé et fourni des modèles d’organoïdes pulmonaires présentant des défauts spécifiques dans l’ultrastructure et la fonction des cils pour valider la capacité de Magnify à visualiser la pathologie des cils cliniquement pertinente.
« Avec les dernières techniques Magnify, nous pouvons étendre ces tissus pulmonaires et commencer à voir une ultrastructure des cils mobiles même avec un microscope ordinaire, ce qui accélérera les investigations de base et cliniques », a-t-il déclaré.
Les chercheurs ont également pu visualiser des défauts dans les cils dans des cellules pulmonaires spécifiques au patient connues pour avoir des mutations génétiques.
« La communauté de l’ingénierie des tissus pulmonaires a toujours besoin d’un meilleur moyen de caractériser le système tissulaire avec lequel nous travaillons », a déclaré Ren. Il a ajouté que ce travail est une première étape importante et il espère que le travail de collaboration avec le laboratoire de Zhao sera encore affiné et appliqué aux échantillons de pathologie trouvés dans les banques de tissus.
Enfin, l’hydrogel utilisé dans Magnify et développé dans le laboratoire de Zhao est plus robuste que son prédécesseur, qui était très fragile, provoquant des ruptures au cours du processus.
« Nous espérons développer cette technologie pour la rendre plus accessible à la communauté », a-t-il déclaré. « Cela peut aller dans différentes directions. Il y a beaucoup d’intérêt à utiliser ce type de technologie d’expansion tissulaire pour la science fondamentale. »
Alison Barth, professeur Maxwell H. et Gloria C. Connan en sciences de la vie à Carnegie Mellon, étudie la connectivité synaptique pendant l’apprentissage. Elle a déclaré que les vastes applications fournies par les nouvelles méthodes seront une aubaine pour les chercheurs.
« Le cerveau est un endroit idéal pour tirer parti de ces techniques de super-résolution », a déclaré Barth, qui collabore avec le Zhao Lab sur plusieurs études. « Les méthodes de microscopie seront bénéfiques pour le phénotypage synaptique et l’analyse dans différentes conditions cérébrales.
« L’une des avancées majeures de cet article est la capacité de la méthode à travailler sur de nombreux types différents d’échantillons de tissus. »
Les autres auteurs de l’étude incluent Piyumi Wijesekara, Emma F. DiBernardo, Zhangyu Cheng de Carnegie Mellon ; Sinda Fekir et Christopher I. Moore de l’Université Brown ; Donna B. Stolz de Pitt; Franca Cambi de Pitt et de l’administration des anciens combattants ; et Steven L Brody et Amjad Horani de l’Université de Washington.
Plus d’information:
Yongxin Zhao, Magnify est une stratégie d’ancrage moléculaire universelle pour la microscopie d’expansion, Biotechnologie naturelle (2023). DOI : 10.1038/s41587-022-01546-1. www.nature.com/articles/s41587-022-01546-1