Comprendre le microbiome environnemental grâce à la microscopie confocale

La technologie confocale est l’une des avancées les plus importantes en microscopie optique, et de nombreuses disciplines au sein de Texas A&M AgriLife et d’autres parties du système universitaire Texas A&M découvrent qu’elle peut également changer la donne dans leurs recherches.

Brian Shaw, Ph.D., professeur au Département de pathologie végétale et de microbiologie, PLPM, au Texas A&M College of Agriculture and Life Sciences est un expert en microscopie confocale. Il applique non seulement cette technologie de pointe dans ses propres recherches, mais encourage également les étudiants de premier cycle et des cycles supérieurs, ainsi que d’autres chercheurs, à l’utiliser pour faire avancer leurs propres efforts scientifiques.

Qu’est-ce que la microscopie confocale ?

« La microscopie confocale offre plusieurs avantages par rapport à la microscopie conventionnelle, notamment la capacité de contrôler la profondeur de champ et de réduire ou d’éliminer la lumière floue dans la formation d’image sur le plan focal », explique Shaw.

« Cela vous donne également la possibilité de travailler avec des cellules vivantes et de voir les changements qu’elles apportent en temps réel, ainsi que de collecter des coupes en série à partir de spécimens épais », a-t-il déclaré. « De plus, il peut produire une image presque 3D de la cellule, vous permettant de la visualiser sous différentes perspectives. »

Le microscope confocal principal de Shaw, qui permet une large gamme de modalités d’imagerie, est situé dans le bâtiment de pathologie végétale et de microbiologie sur le campus Texas A&M.

Il s’agit d’un microscope confocal à balayage laser Olympus FV3000 avec quatre détecteurs et six lignes laser, qui permettent l’imagerie simultanée de canaux à quatre couleurs de presque tous les fluorophores. Il est entièrement motorisé avec autofocus, permettant une imagerie accélérée pendant des heures sans perdre la mise au point. La platine motorisée de précision du microscope permet un time-lapse en plusieurs points de divers spécimens simultanément.

Microscopie confocale et détermination de l’infection pathogène

Selon des recherches dans le Revue multidisciplinaire d’écologie microbienne, le journal officiel de la Société internationale d’écologie microbienne, plus de 80 % des maladies des cultures sont causées par des champignons ou des agents pathogènes de type champignon. Ces maladies entraînent des milliards de dollars de pertes de récoltes et menacent la sécurité alimentaire.

Shaw a déclaré qu’une grande partie de la recherche que lui et son équipe font concerne la détermination de la machinerie cellulaire impliquée dans la croissance et le développement des champignons et le fonctionnement des pathogènes fongiques.

« Nous étudions les caractéristiques de surface des spores fongiques et leur influence sur la dispersion des spores », a-t-il déclaré. « La spore fongique est la cellule dormante que ces organismes utilisent pour se disperser à travers la distance et dans le temps. »

Shaw a déclaré que les champignons nécessitent une croissance polarisée des hyphes pour avoir un impact sur les plantes et les humains, donc comprendre comment les hyphes sont fabriqués est une préoccupation fondamentale. Un hyphe est l’unité de base d’un champignon filamenteux et se compose généralement d’une chaîne de cellules allongées qui se développent au sommet de la cellule de pointe. Les cellules allongées en forme de fil ne se développent qu’à leur sommet hautement polarisé et leur croissance est caractérisée par l’établissement initial d’un site de croissance, qui est suivi de son entretien continu.

« Notre laboratoire examine la dynamique temporelle et spatiale des composants du cytosquelette pendant la croissance et le développement des hyphes fongiques », a-t-il déclaré. « En utilisant le microscope confocal, nous avons constaté que les spores de l’important agent pathogène du maïs, Colletotrichum graminicola, sont asymétriques. Et ces spores ne peuvent se fixer à leur nouvel hôte que sur une face de la spore. »

Shaw a déclaré que puisque l’attachement à leur nouvel hôte est nécessaire pour commencer le cycle de la maladie dans le maïs, cette découverte identifie une nouvelle cible essentielle pour perturber la maladie fongique du maïs.

« Avec l’aide de cette imagerie à plus haute résolution, presque 3D, nous avons pu déduire une corrélation entre le site de fixation et le site d’infection par l’agent pathogène fongique », a-t-il déclaré. « La microscopie confocale nous permet de voir ces structures et leurs composants à un niveau de détail qui n’était pas disponible auparavant. Nous pouvons désormais obtenir une meilleure image de la croissance des champignons et identifier les hyphes de champignons spécifiques et leur rôle dans le déclenchement de la maladie.

Utilisation de la microscopie confocale par les étudiants de premier cycle et des cycles supérieurs

Oli Bedsole, un étudiant diplômé du Département de pathologie végétale et de microbiologie qui travaille dans le laboratoire de Shaw, a déclaré qu’il utilise la microscopie confocale pour étudier comment différentes protéines interagissent et s’associent dans les champignons.

« J’étudie l’adhésif des spores fongiques qui leur permet de se fixer et d’infecter plus tard les plantes, comme le maïs », a déclaré Bedsole. « La résolution d’un confocal est primordiale et me permet de voir où se trouve l’adhésif, où se trouvent des protéines spécifiques et comment elles interagissent. »

Bedsole a déclaré avoir appris les bases de la microscopie confocale auprès de Shaw et d’autres membres du laboratoire, puis avoir suivi une formation complémentaire dans le cadre du cours de troisième cycle Théorie et applications de la microscopie optique.

« Nous imaginons presque exclusivement des échantillons de cellules vivantes et obtenons une résolution incroyable », a-t-il déclaré. « La microscopie confocale nous permet de faire des constructions 3D, nous donnant une perspective et une clarté uniques. C’est aussi un outil puissant pour nous aider à communiquer notre science aux autres puisqu’ils peuvent voir cette image 3D. »

Mary Cowser, étudiante de premier cycle travaillant avec Bedsole, a déclaré que l’imagerie de la microscopie confocale aide à donner vie à la science.

« Créer des images avec des couleurs vibrantes en colorant différentes parties de structures fongiques nous donne une image de cette structure rehaussée de couleur », a-t-elle déclaré. « Et être capable de voir des structures en 3D à mesure qu’elles grandissent en temps réel est fascinant et peut donner beaucoup d’informations sur leur fonctionnement. Ces images nous aident à en savoir plus sur les agents pathogènes et leurs mécanismes, ce qui profite aux sciences de l’environnement. »

Bedsole, Cowser et d’autres dans les classes de Shaw reçoivent une formation spécialisée et diverses expériences liées aux techniques des sciences biologiques.

« Il existe une variété d’applications pour la microscopie confocale en microbiologie et en sciences de l’environnement », a déclaré Shaw. « Avoir une formation sur l’utilisation de cette technologie offre un niveau supplémentaire d’expérience et d’expertise aux étudiants en sciences de l’environnement, et la technologie elle-même peut leur être très utile s’ils poursuivent une carrière dans laquelle ils abordent les problèmes biologiques dans l’environnement. »

Utilisation multidisciplinaire de la microscopie confocale au Texas A&M

Shaw a déclaré qu’en plus des applications dans la pathologie végétale, la microbiologie et les sciences bioenvironnementales dans leur ensemble, la microscopie confocale profite à d’autres disciplines universitaires.

Shaw et son équipe ont collaboré avec d’autres chercheurs du Texas A&M sur l’utilisation interdisciplinaire et multidisciplinaire de cette technologie pour faire avancer la science.

Par exemple, Matthew Sachs, Ph.D., professeur au Département de biologie du Collège des arts et des sciences, et l’étudiant diplômé Matthew Breuer ont utilisé la microscopie confocale dans leurs recherches sur de nouvelles méthodes de lutte contre les agents pathogènes fongiques.

Parmi les agents pathogènes fongiques qu’ils étudient figure Cryptococcus neoformans, responsable d’environ 181 000 décès estimés par an. Les infections cérébrales à C. neoformans, appelées méningites à cryptocoques, surviennent principalement en Afrique subsaharienne.

Sachs a déclaré que l’utilisation de la microscopie confocale a été essentielle dans ses recherches pour comprendre l’efficacité potentielle de la sertralineun antidépresseur couramment prescrit, comme traitement antifongique.

« La rareté des traitements et la résistance croissante aux thérapeutiques actuelles mettent en évidence la nécessité de développer ou d’identifier de nouveaux antifongiques adaptés à une utilisation clinique », a-t-il déclaré. « Nos recherches précédentes ont montré que la sertraline a des propriétés antifongiques, et la réutilisation de composés existants approuvés par la FDA comme la sertraline en tant que thérapeutique antimycosique pourrait être une stratégie efficace et efficiente. »

Sachs et son équipe ont utilisé la microscopie confocale pour obtenir des images à plus haute résolution de cellules vivantes de Cryptococcus et voir comment elles étaient affectées par la sertraline.

« Ces images que nous avons obtenues en collaboration avec le Dr Shaw ont été essentielles pour orienter nos recherches et savoir où concentrer nos efforts pour découvrir des connexions importantes qui peuvent nous aider à combattre les infections fongiques », a-t-il déclaré.

Dans un autre effort de collaboration avec le laboratoire de Shaw, ZJ Pei, Ph.D., professeur au College of Engineering Wm Michael Barnes ’64 Department of Industrial and Systems Engineering, et Hongmin Qin, Ph.D., professeur agrégé au Department of Biology , ainsi que d’autres ont utilisé la microscopie confocale pour la recherche liée à la bio-impression utilisant des cellules végétales ou algales.

« Des études antérieures sur les effets de la pression d’extrusion et du diamètre de l’aiguille sur la viabilité cellulaire dans la bio-impression ont utilisé des cellules animales, mais auparavant, il n’y avait aucun rapport sur la façon dont elles affectaient la viabilité cellulaire en utilisant des cellules végétales ou d’algues », a déclaré Pei. « La quantité de cellules est un indicateur majeur de la viabilité cellulaire, et notre équipe a utilisé la microscopie confocale pour mesurer la quantité de cellules d’échantillons imprimés en 3D. »

Les résultats de « Bioprinting Using Algae: Effects of Extrusion Pressure and Needle Diameter on Cell Quantity in Printed Samples » ont été imprimés dans le Journal des sciences et de l’ingénierie de la fabrication, une publication de l’American Society of Mechanical Engineers.

« La connaissance des tendances des effets de la pression d’extrusion et du diamètre de l’aiguille sur la quantité de cellules d’algues sera bénéfique pour l’impression avec des algues, en particulier pour déterminer les bons niveaux de pression d’extrusion et de diamètre d’aiguille », a déclaré Pei.

Shaw et Pei collaborent également au développement de la technologie pour imprimer en 3D des biodéchets colonisés par des champignons, tels que des coques de riz ou de la paille, pour les utiliser comme matériaux de construction.

Des recherches plus cruciales sur le microbiome environnemental

Sanjay Antony-Babu, Ph.D., professeur adjoint au Département de pathologie végétale et de microbiologie, utilise la microscopie confocale pour en savoir plus sur le « pathobiome », ou comment le microbiome influence les champignons du sol qui causent les maladies des plantes.

En étroite collaboration avec Tom Isakeit, Ph.D., un phytopathologiste du Texas A&M AgriLife Extension Service, Antony-Babu a déclaré qu’ils enquêtaient sur les pathobiontes du champignon fusarium, qui provoque le flétrissement de diverses cultures, y compris le coton.

« Ce champignon végétal est un problème mondial et cause des dommages et des pertes aux cultures de coton dans le monde entier », a-t-il déclaré. « Nous examinons quelles bactéries pourraient s’attacher et aider ce champignon pathogène. »

Antony-Babu a déclaré que les microbiomes du sol sont très complexes et qu’il est possible de trouver plus de 10 milliards de bactéries dans un gramme de sol.

« Aucun organisme dans le sol n’est seul. Ce n’est que récemment que nous sommes en mesure de les étudier en tant que groupes plutôt qu’en tant qu’individus », a-t-il déclaré. « La visualisation confocale est l’un des principaux moyens d’étudier les microbiomes. »

Antony-Babu a déclaré que son équipe utilise une technique d’appâtage fongique où les champignons pathogènes recrutent les bactéries pour lesquelles il existe une attraction naturelle.

« Nous utilisons également une combinaison de techniques moléculaires et d’imagerie – méthodes de séquençage ADN/ARN, analyses basées sur la culture et imagerie confocale – pour découvrir quels organismes interagissent directement les uns avec les autres pour déclencher une maladie des plantes », a-t-il déclaré.

Shaw a également collaboré avec Jeanmarie Verchot, Ph.D., professeure au Département de pathologie végétale et de microbiologie dont les recherches portent sur les interactions virus-hôte, en utilisant la microscopie confocale pour documenter la réplication du virus dans les plantes.

« Les champignons sont des composants cruciaux du microbiome environnemental qui nous entoure », a déclaré Shaw.

Il a noté que les champignons jouent un rôle dans le cycle des nutriments par la dégradation des déchets organiques, ainsi que dans les nombreuses maladies affectant les plantes et les animaux.

« Il y a aussi la menace de spores fongiques toxiques dégradant la qualité de l’air dans nos environnements bâtis, donc les champignons nous affectent tous quotidiennement », a déclaré Shaw.

Il a déclaré que comprendre comment les champignons se reproduisent et se développent dans l’environnement à l’aide de la microscopie confocale avancée est la clé de la santé et de la prospérité humaines et une composante majeure des sciences bioenvironnementales.