Auparavant, il était impossible de capturer les images haute résolution de la nitrogénase, la seule enzyme capable de réduire l’azote en ammoniac, lors de l’action catalytique. Maintenant, pour la première fois, des chercheurs de l’Université de Californie à San Diego rapportent des instantanés à résolution quasi atomique de la nitrogénase pendant la catalyse à l’aide de la microscopie électronique cryogénique (cryoEM). Les résultats ont été publiés dans la revue La science.
Ce travail a été accompli grâce à un partenariat étroit entre les groupes du professeur Akif Tezcan et du professeur adjoint Mark Herzik, tous deux du département de chimie et de biochimie de l’UC San Diego. Alors que Tezcan a longtemps étudié la nitrogénase, Herzik a fourni l’expertise cryoEM nécessaire pour mener à bien la recherche.
« Il s’agit d’une avancée très importante en termes de fixation biologique de l’azote ainsi que de biologie structurale, en général », a déclaré Tezcan. « Pouvoir obtenir des images à résolution atomique d’une enzyme aussi dynamique et complexe que la nitrogénase en action est extrêmement excitant. Cela ouvre la porte à une compréhension complète du mécanisme de cette enzyme énigmatique, qui préoccupe les chercheurs depuis des décennies. »
Comprendre l’importance de ces images cryoEM nécessite de comprendre l’énorme importance mondiale de la fixation de l’azote. Tous les organismes ont besoin de sources « fixes » d’azote pour la biosynthèse des éléments constitutifs de la vie tels que les protéines et l’ADN. Cependant, la plupart des organismes vivants ne possèdent pas l’enzyme nitrogénase et ne peuvent pas métaboliser l’azote atmosphérique en une forme biotransformable.
La nitrogénase était essentiellement la seule source d’azote fixé dans la biosphère jusqu’à l’avènement du procédé Haber-Bosch – la procédure industrielle de conversion de l’azote atmosphérique en ammoniac – il y a plus de cent ans. L’ammoniac produit industriellement est largement utilisé pour les engrais et son avènement a révolutionné les pratiques agricoles dans la première moitié du XXe siècle. Le processus Haber-Bosch a souvent été cité comme le facteur déterminant de l’explosion démographique mondiale au cours du siècle dernier, ayant « transformé l’air en pain ».
Cependant, le procédé Haber-Bosch est très énergivore, nécessitant des températures supérieures à 400°C et des pressions élevées d’hydrogène gazeux. On estime que 1 à 2 % de toute la production mondiale d’énergie est consommée par le procédé Haber-Bosch. Le processus soulève également des préoccupations environnementales, notamment la lixiviation des nitrates dans les eaux souterraines et des émissions plus élevées d’oxyde nitreux, un gaz à effet de serre.
Une question clé qui motive la recherche biologique sur la fixation de l’azote est le contraste entre la nitrogénase et le processus Haber-Bosch. Comment l’enzyme catalyse-t-elle la réduction de l’azote à température et pression ambiantes alors que le procédé industriel nécessite des conditions aussi extrêmes ?
« Si nous pouvons comprendre le mécanisme de la nitrogénase, nous pouvons non seulement comprendre pourquoi la nature l’a transformée en une enzyme aussi complexe, mais nous pourrions également découvrir des principes de conception pour la production d’ammoniac d’une manière plus rentable et plus respectueuse de l’environnement », a déclaré Tezcan.
Bien que l’on sache beaucoup de choses sur la structure de la nitrogénase, jusqu’à présent, personne n’a été en mesure d’acquérir des images à résolution atomique de l’enzyme tout en « retournant » ou en train de catalyser l’azote atmosphérique en ammoniac, en grande partie en raison de limitations technologiques.
Pour la première fois, des chercheurs de l’Université de Californie à San Diego rapportent des images et des vidéos à résolution quasi atomique de la nitrogénase pendant la catalyse à l’aide de la microscopie électronique cryogénique (cryoEM). Crédit : Groupes Tezcan et Herzik / UC San Diego
Bien que les scientifiques puissent obtenir des images à résolution atomique de protéines à l’aide de la cristallographie aux rayons X, cette méthode nécessite que les protéines soient fixées en place dans un cristal – stationnaire dans un sens – ce qui signifie qu’il ne peut pas capturer la nitrogénase en action. La catalyse à la nitrogénase nécessite que différentes parties de l’enzyme s’associent les unes aux autres, puis se séparent plusieurs fois pour former une seule molécule d’ammoniac à partir d’azote. Le processus est tout sauf stationnaire.
CryoEM permet non seulement aux chercheurs de capturer les structures des protéines sans qu’elles soient fixées dans des cristaux, mais grâce aux progrès récents du matériel et du traitement des données, de le faire avec une résolution atomique. Une résolution aussi élevée est nécessaire pour visualiser les petits changements associés à la catalyse enzymatique.
Ces avancées ont conduit Tezcan et l’étudiante diplômée Hannah Rutledge à envisager d’utiliser la cryoEM pour étudier la nitrogénase en action catalytique. Et pour cela, ils ont demandé l’aide de l’expert résident en cryoEM Mark Herzik et des membres de son groupe Brian Cook et Hoang Nguyen.
« C’était à la fois un projet passionnant et un défi technologique à poursuivre, pendant la pandémie non moins. Bien que la cryoEM soit une technique très performante, peu d’études ont rendu compte des enzymes pendant qu’elles subissent une catalyse. Les informations critiques et les développements technologiques de cette étude non seulement ouvrent la voie à de futures explorations du mécanisme de la nitrogénase mais des enzymes en général », a déclaré Herzik.
Herzik et Rutledge ont travaillé en étroite collaboration pour préparer des centaines d’échantillons cryoEM. Parce que la nitrogénase est sensible à l’oxygène, les échantillons ont été préparés dans une boîte à gants anaérobie, puis rapidement transférés et congelés en quelques secondes pour éviter toute dégradation. Au final, l’équipe a collecté plus de 15 000 vidéos capturant plus de 20 millions de molécules individuelles à différents stades de la catalyse.
Il a fallu près d’un an aux équipes pour trier plusieurs téraoctets de données : elles ont écarté les images de mauvaise qualité, puis identifié et classé toutes les particules. Finalement, ils ont pu obtenir les premières images à résolution atomique de la nitrogénase au milieu du renouvellement.
Les structures cryoEM ont révélé plusieurs caractéristiques inattendues de la nitrogénase qui n’étaient auparavant pas observées dans les structures à rayons X. Fait important, les nouvelles observations fournissent une nouvelle hypothèse mécaniste pour la catalyse à la nitrogénase. Tezcan et Herzik espèrent collaborer encore de nombreuses années pour tester ces hypothèses et comprendre en détail le mécanisme catalytique de la nitrogénase.
« Ce n’est que le début », a déclaré Tezcan. « Nous avons maintenant une image de l’enzyme entière, pas seulement d’une partie spécifique, pendant l’action catalytique. Cela ouvrira vraiment les vannes à d’autres recherches pour comprendre le fonctionnement de la nitrogénase, et potentiellement, sur la route, développer des processus plus efficaces pour produire des composés fixes. azote. »
Hannah L. Rutledge et al, Structures du complexe de nitrogénase préparé dans des conditions de renouvellement catalytique, La science (2022). DOI : 10.1126/science.abq7641. www.science.org/doi/10.1126/science.abq7641