Découvrir le mécanisme de cyclisation de la β-1,2-glucane synthase cyclique

Le polysaccharide β-1,2-glucane est constitué d’unités répétitives de glucose liées entre elles par des liaisons β-1,2-glycosidiques. Les β-1,2-glucanes (CβG) cycliques sont présents dans différentes espèces bactériennes et jouent un rôle dans les infections bactériennes et les relations symbiotiques. La biosynthèse du CβG est catalysée par la β-1,2-glucane synthase cyclique (CGS), une enzyme qui catalyse la cyclisation (formation d’anneaux fermés) du β-1,2-glucane linéaire (LβG).

Étant donné que la méthode de synthèse enzymatique à grande échelle du β-1,2-glucane linéaire a déjà été établie, sa combinaison avec cette enzyme est techniquement réalisable pour une synthèse efficace en un seul pot du β-1,2-glucane cyclique. Cependant, l’activité cyclisante de cette enzyme n’est pas très forte et sa stabilité en tant qu’enzyme est également faible.

Des études antérieures ont révélé que la liaison du glucose au CGS, l’élongation des chaînes LβG, l’ajustement de la longueur de la chaîne des glucanes et la cyclisation des glucanes sont répartis sur trois domaines distincts du CGS. Cependant, même s’il est connu que le domaine enzymatique situé dans la région médiane du CGS cyclise les LβG, le mécanisme détaillé de ce processus a jusqu’à présent échappé aux scientifiques.

Récemment, une équipe de chercheurs japonais a découvert le mécanisme catalytique de la cyclisation du CGS suite à des analyses fonctionnelles et structurelles du domaine de cyclisation du CGS de la bactérie Thermoanaerobacter italicus (TiCGSCy). L’équipe était dirigée par le professeur adjoint Nobukiyo Tanaka du Département des sciences biologiques appliquées de l’Université des sciences de Tokyo (TUS) et comprenait le Frère. Ryotaro Saito, le professeur agrégé Masahiro Nakajima et le professeur agrégé Tomoko Masaike, tous de TUS, ainsi que le professeur agrégé Hiroyuki Nakai de l’Université de Niigata et le Dr Kaito Kobayashi de l’Institut national des sciences et technologies industrielles avancées (AIST).

Leurs conclusions ont été publiées dans la revue Microbiologie appliquée et biotechnologie.

Le Dr Tanaka précise : « Les CGS sont des enzymes importantes d’un point de vue physiologique, car les CβG sont impliqués dans diverses maladies bactériennes et relations symbiotiques. Nous tenions à fournir des informations sur la structure et la fonction des CGS, qui retiennent l’attention dans la recherche mais pour lesquelles le Le mécanisme de la cyclisation du β-1,2-glucane reste un mystère. »

La première étape de la recherche consistait à exprimer le domaine de cyclisation seul, TiCGSCy, en tant qu’enzyme recombinante chez Escherichia coli.

La prochaine étape vers la caractérisation impliquait l’analyse des produits de réaction lorsque les LβG étaient utilisés comme substrat pour TiCGSCy. « Nous avons découvert que TiCGSCy produisait des composés résistants à la β-glucosidase. En les examinant par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, nous avons trouvé des CβG. C’était la première preuve que TiCGSCy produisait des CβG », explique le Dr Tanaka.

Pour déterminer les schémas d’action de TiCGSCy sur les LβG, l’équipe a traité TiCGSCy avec des β-1,2-gluoligosaccharides (LβG comprenant 2 à 10 unités de glucose) et analysé les produits. Les produits de réaction ont révélé que le mécanisme TiCGSCy manquait de réaction d’hydrolyse, comportait une transglycosylation et nécessitait des substrats d’au moins hexasaccharide (polymères de six unités glucose ou plus) de longueur.

Cette découverte correspond aux données d’études précédentes dans lesquelles des CGS associés produisaient des CβG avec des polymères d’environ 20 unités de glucose. Enfin, il a été suggéré que TiCGSCy possède un mécanisme de rétention de l’anomère, car il génère un produit avec le même anomère que son substrat.

En outre, l’analyse structurelle de TiCGSCy par cristallographie aux rayons X a montré que TiCGSCy, les β-1,2-glucanases de Chitinophaga pinensis (CpSGL, appartenant à GH144) et le champignon Talaromyces funiculosus (TfSGL, appartenant à GH162) sont structurellement similaires, bien que leur homologie de séquence d’acides aminés est très faible.

La structure complexe de CpSGL (GH144), la structure complexe de Michaelis de TfSGL (GH162) et la structure globale de TiCGSCy ont été superposées pour explorer les résidus catalytiques de TiCGSCy.

En conséquence, E1356 s’est avéré être situé en mesure d’agir sur l’atome d’oxygène de la liaison glycosidique au site de clivage via le groupe 3-OH de la molécule de glucose au sous-site +2, et E1442 a été positionné pour effectuer directement une attaque nucléophile sur le centre anomérique du sous-site –1. Par conséquent, ils ont été déduits qu’il s’agissait respectivement de l’acide/base général et du résidu nucléophile pour la catalyse.

Le mécanisme de réaction détaillé du TiCGSCy est le suivant :

Dans la réaction mentionnée ci-dessus, il a été suggéré que lorsque le groupe hydroxyle d’une molécule différente de celle formant l’intermédiaire glycosyl-enzyme attaque l’atome de carbone anomère dans (a), un produit linéaire est obtenu. À l’inverse, lorsque le groupe hydroxyle attaquant provient de la même molécule, un produit cyclique se forme.

Dans l’ensemble, ces résultats ont des implications significatives pour la caractérisation de TiCGSCy. « Compte tenu de son mécanisme de réaction non canonique, ce CGS définit une nouvelle famille de glycosides hydrolases, GH189 », explique le Dr Tanaka.

En conclusion, grâce à cette recherche, les chercheurs ont identifié des résidus importants pour l’activité cyclisante, ce qui conduit à la recherche souhaitée d’enzymes ayant une activité cyclisante plus forte et une stabilité plus élevée. L’équipe est convaincue que leurs travaux ouvriront des voies de recherche explorant l’inhibition du CGS.