Versteckt in einem kleinen, dunklen Raum im UPMC Hillman Cancer Center ist Brittani Schnable auf einem Angelausflug.
Mit einem Joystick, der denen von Videospielern ähnelt, wirft sie mikroskopisch kleine Kügelchen in einen Ozean aus Molekülen, drückt und zieht die Kügelchen auseinander, bis sie schließlich einen DNA-Strang einfangen. Nach ein paar Fingertipps auf der Tastatur beginnt eine Lichtshow. Eine Explosion von Farben blitzt über den schwarzen Bildschirm wie ein Feuerwerk, das am Nachthimmel explodiert.
Obwohl diese Farben zunächst zufällig erscheinen, beginnt sich ein Muster abzuzeichnen. Linien aus blauem und rotem Licht streifen über den Bildschirm: Ein DNA-Reparaturprotein hat sich an die Schadensstelle gebunden.
Schnable, ein Ph.D. Student im Labor von Dr. Bennett Van Houten an der University of Pittsburgh, verwendet eine Spitzentechnologie namens C-Trap, die ein einzelnes DNA-Molekül manipuliert, und eine neue Methode, die diese Woche in beschrieben wird Nukleinsäureforschung– ermöglicht eine schnelle und einfache Produktion von Proteinen für die Einzelmolekül-Visualisierung.
Das neuartige System gibt Van Houten und seinem Team einen beispiellosen Detaillierungsgrad, der ihnen helfen wird zu erforschen, wie Zellen beschädigte DNA finden und reparieren, Informationen, die eines Tages verwendet werden könnten, um Krebs in seinen Spuren zu stoppen.
„Ich stelle mir DNA-Schäden gerne als Schlagloch vor“, sagte Van Houten, Ph.D., Professor am Department of Pharmacology & Chemical Biology von Pitt. „Bei einem bestimmten DNA-Reparaturweg sind etwa 30 Proteine erforderlich, um vom Auffinden des Schlaglochs bis zum Anbringen des Reparaturpflasters zu gelangen. Wir können zwar nicht alle diese Proteine gleichzeitig beobachten, aber wir können sie paarweise beobachten.“
Van Houtens Labor interessiert sich für Reparaturproteine, die DNA-Läsionen heilen, die durch Umweltfaktoren wie ultraviolette (UV) Strahlung der Sonne und Umweltschadstoffe verursacht werden. Wenn diese Reparaturwege zusammenbrechen, können DNA-Schäden zu Alterung, Krebs, Neurodegeneration und anderen Krankheiten beitragen.
In der neuen Studie nutzten die Forscher die C-Falle, um zu untersuchen, wie verschiedene DNA-Reparaturproteine ihre jeweiligen Formen von Schäden erkennen und daran binden.
Das C-Trap-System stützt sich auf eine mit dem Nobelpreis ausgezeichnete Technologie namens optische Pinzette, die einen starken Lichtstrahl verwendet, um mikroskopisch kleine Kügelchen zu greifen und zu bewegen, bis sie an beiden Seiten eines Moleküls – in diesem Fall einem Strang beschädigter DNA – haften bleiben.
„Sie können die beiden Perlen zusammenschieben und hoffen, dass die beiden DNA-Enden wie ein Klettverschluss an jeder Perle einrasten. Wenn Sie die Perlen weiter auseinander bewegen, können Sie tatsächlich das Kraftmaß der DNA wie eine Feder oder ein Gummiband spüren. “, sagte Erstautor Matthew Schaich, Ph.D., ein Postdoktorand im Van Houten Lab.
Sobald der DNA-Köder gesetzt ist, ist es Zeit, nach Proteinen zu fischen.
In Zusammenarbeit mit Forschern der University of Kent entwickelte die Van Houten-Gruppe eine neue Methode namens Einzelmolekülanalyse von DNA-bindenden Proteinen aus Kernextrakten oder SMADNE. Diese Technik ermöglicht es Benutzern, fluoreszierend markierte Proteine viel schneller und einfacher herzustellen als herkömmliche Methoden. Mithilfe von SMADNE extrahierten die Forscher DNA-Reparaturproteine aus dem Zellkern. Anschließend führten sie diese Proteine in die C-Falle ein und analysierten, wie und wann sie an DNA binden, die verschiedene Arten von Schäden enthält.
Schaich interessierte sich für die Beziehung zwischen zwei bestimmten Reparaturproteinen, DDB1 und DDB2, die dabei helfen, durch die Sonne verursachte Schäden zu reparieren, und beobachtete, wie diese Proteine als mehrfarbige Lichtflecken auf der DNA auf- und absprangen, und untersuchte, wie sie sich der Stelle näherten und sich von ihr zurückzogen UV-Schäden.
Eine molekulare Lichtshow: Ein DNA-Strang mit UV-Schäden wird zwischen zwei Kügelchen auf der C-Falle aufgereiht. Dieses beschleunigte Video zeigt die DNA-Reparaturproteine DDB1 (blau) und DDB2 (rot), die getrennt oder zusammen (lila) über etwa 12 Minuten an geschädigte Stellen binden und sich von diesen lösen. Quelle: Schaich et al., 2023, Nucleic Acids Research, doi:10.1093/nar/gkad095
„Sie haben einen Bereich mit DNA-Schäden und möchten wissen, wie eine Zelle diesen erkennen und reparieren kann“, erklärt Schaich. „Eines der wichtigsten Dinge, die es zu verstehen gilt, ist, wer zuerst dort ankommt. Bleibt es nach seiner Ankunft für die gesamte Reparaturkaskade da? Übergibt es die Reparatur an ein anderes Protein? Mit der C-Falle können Sie die Proteine beobachten kommen und gehen und viel über die Reihenfolge des Auf- und Abbaus erfahren.“
Van Houten denkt an DNA-Reparaturproteine wie Menschen, die sich in einer Bar unterhalten.
„Zwei Leute gehen in eine Bar. Wer geht zuerst durch die Tür? Wie lange sitzen sie zusammen an der Bar, und wer verlässt die Bar dann zuerst? DNA-Reparaturproteine sind wie Menschen dynamisch“, sagte Van Houten.
Die Forscher fanden heraus, dass DDB1 und DDB2, wenn sie an der Schadensstelle zusammenarbeiteten, normalerweise wie erwartet zusammen an der DNA ankamen und zusammen abreisten. Überraschenderweise sahen sie jedoch auch 11 verschiedene Assoziations- und Dissoziationsmuster, wobei die beiden Proteine zu unterschiedlichen Zeiten ein- und ausgingen, was die unglaublichen Details hervorhebt, die Wissenschaftler mit dieser neuen Technologie beobachten können.
Zusätzlich zu DDB1 und DDB2 verwendete das Team von Van Houten die C-Falle und SMADNE, um die Aktivitäten einer Vielzahl von DNA-Reparaturproteinen aus mehreren verschiedenen Reparaturwegen zu untersuchen, um das Verständnis dieser Reparatursysteme zu verbessern.
Indem sie lernen, wie unsere DNA-Reparaturprozesse funktionieren, können Wissenschaftler besser verstehen, wie Störungen in diesen Signalwegen zu Krankheiten wie Krebs führen können, und die Suche nach besseren Behandlungen vorantreiben.
„Die DNA-Reparatur ist ein zweischneidiges Schwert“, erklärte Van Houten. „Wenn Sie keine effiziente Reparatur haben, könnten Umweltstressoren so viel Schaden anrichten, dass sich Krebs entwickelt. Auf der anderen Seite töten viele Krebsbehandlungen Tumore, indem sie auf DNA-Reparaturmechanismen abzielen.“
Van Houten und sein Team haben ein Patent für ihr SMADNE-System angemeldet und werden weiterhin alle 30 Proteine in diesem Reparaturweg für UV-Schäden analysieren.
„Die Kombination aus C-Trap und SMADNE hat endlose Möglichkeiten für die Untersuchung der DNA-Reparatur eröffnet. Aber was ist die wichtigste Frage, die wir mit diesem neuen Werkzeug beantworten können?“ sagte van Houten. „Für mich bedeutet es, die genaue Rolle jedes der Proteine in diesem Weg zu kennen.“
Andere Forscher an der Studie waren Namrata Kumar, Ph.D., Vera Roginskaya und Rachel Jakielski, alle von Pitt oder UPMC; Roman Urban und Neil Kad, Ph.D., beide von der University of Kent; und Zhou Zhong, Ph.D., von LUMICKS.
Mehr Informationen:
Mathew Schaich et al, Einzelmolekülanalyse von DNA-bindenden Proteinen aus Kernextrakten (SMADNE), Nukleinsäureforschung (2023). DOI: 10.1093/nar/gkad095