Wissenschaftler lösen Rätsel der Erkennung und Reparatur von DNA-Schäden durch Sonnenlicht, Alkohol und Umweltverschmutzung

Eine Zusammenarbeit zwischen Forschern des Laboratory of Medical Sciences (LMS) in London und des Laboratory of Molecular Biology (LMB) in Cambridge hat ein jahrzehntealtes Rätsel gelöst, das den Weg für bessere Krebsbehandlungen in der Zukunft ebnen könnte.

Die Arbeit, die den grundlegenden Mechanismus aufdeckte, wie eines unserer wichtigsten DNA-Reparatursysteme DNA-Schäden erkennt und ihre Reparatur einleitet, war den Forschern viele Jahre lang ein Rätsel. Mithilfe modernster Bildgebungstechniken wird sichtbar, wie sich diese DNA-Reparaturproteine ​​auf einem einzelnen DNA-Molekül bewegen, und mithilfe der Elektronenmikroskopie wird erfasst, wie sie sich an bestimmte DNA-Strukturen „anheften“. Damit eröffnet diese Forschung den Weg zu wirksameren Krebsbehandlungen.

Die Zusammenarbeit zwischen den Laboren von Professor David Rueda (LMS) und Dr. Lori Passmore (LMB) ist ein hervorragendes Beispiel dafür, wie #Teamscience fruchtbare Ergebnisse hervorbringen kann, und unterstreicht die Bedeutung dieser beiden Institute für die Förderung von Forschung, die die grundlegenden Mechanismen der Biologie entschlüsselt, welche die Grundlage für die zukünftige Umsetzung dieser Arbeit in Verbesserungen der menschlichen Gesundheit bilden.

Die Forscher arbeiteten an einem DNA-Reparaturweg, der als Fanconi-Anämie bekannt ist [FA] Weg, der vor mehr als 20 Jahren identifiziert wurde.

Die DNA wird im Laufe unseres Lebens durch Umweltfaktoren wie UV-Licht der Sonne, Alkoholkonsum, Rauchen, Verschmutzung und Kontakt mit Chemikalien ständig geschädigt. Eine Art der Schädigung der DNA ist die „Vernetzung“, die dazu führt, dass sie sich nicht mehr normal reproduzieren und Gene exprimieren kann.

Um sich selbst zu replizieren und Gene zu lesen und zu exprimieren, müssen sich die beiden Stränge der DNA-Doppelhelix zunächst in Einzelstränge aufspalten. Wenn DNA vernetzt wird, verkleben die „Nukleotide“ (die „Stufen“ in der Doppelhelixleiter der DNA) der beiden Stränge miteinander und verhindern so das Aufspalten.

Die Anhäufung von DNA-Schäden, einschließlich der Vernetzung, kann zu Krebs führen. Der FA-Pfad ist unser ganzes Leben lang aktiv und erkennt diese Schäden und repariert sie fortlaufend.

Personen mit Mutationen, die diesen Signalweg weniger effektiv machen, sind viel anfälliger für Krebs. Obwohl die am FA-Signalweg beteiligten Proteine ​​schon vor einiger Zeit entdeckt wurden, blieb es ein Rätsel, wie sie die vernetzte DNA identifizierten und den Prozess der DNA-Reparatur starteten.

Das Team der Schwesterinstitution des MRC LMS, des LMB in Cambridge, unter der Leitung von Lori Passmore hatte zuvor festgestellt, dass der Proteinkomplex FANCD2-FANCI (D2-I), der in einem der ersten Schritte des FA-Signalwegs wirkt, sich an die DNA heftet und so die DNA-Reparatur an den Querverbindungen einleitet.

Es blieben jedoch wichtige Fragen offen: Wie erkennt D2-I vernetzte DNA und warum ist der D2-I-Komplex auch an anderen Arten von DNA-Schäden beteiligt?

Die Forschung, veröffentlicht In Naturverwendete eine Kombination modernster wissenschaftlicher Techniken, um zu zeigen, dass der D2-I-Komplex entlang der doppelsträngigen DNA gleitet und dabei deren Integrität überwacht. Darüber hinaus hat er auf elegante Weise visualisiert, wie er erkennt, wo er anhalten muss, sodass sich die Proteine ​​bewegen und an diesem Punkt miteinander verbinden können, um die DNA-Reparatur einzuleiten.

Artur Kaczmarczyk und Korak Ray aus David Ruedas Single Molecule Imaging-Gruppe verwendeten in Zusammenarbeit mit Pablo Alcón aus Lori Passmores Gruppe eine hochmoderne Mikroskopietechnik namens „korrelierte optische Pinzette und Fluoreszenzbildgebung“, um zu untersuchen, wie der D2-I-Komplex entlang eines doppelsträngigen DNA-Moleküls gleitet.

Mithilfe einer optischen Pinzette konnten sie ein einzelnes DNA-Molekül zwischen zwei Perlen einfangen, was ihnen erlaubte, die DNA präzise zu manipulieren und sie mit ausgewählten Proteinen zu inkubieren.

Mithilfe von fluoreszenzmarkiertem D2-I und Einzelmolekülbildgebung beobachteten sie, wie einzelne D2-I-Komplexe an DNA binden und entlang dieser gleiten und dabei die Doppelhelix abtasten. Sie entdeckten, dass die FA-Klemme die Querverbindung zwischen den beiden DNA-Strängen nicht direkt erkennt, sondern aufhört zu gleiten, wenn sie eine Lücke in der einzelsträngigen DNA erreicht, also einen Bereich, in dem einer der beiden DNA-Stränge fehlt.

Mithilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie, einer leistungsstarken Technik, mit der sich Proteine ​​auf molekularer Ebene visualisieren lassen, bestimmten die Forscher als nächstes die Strukturen des D2-I-Komplexes sowohl in seiner Gleitposition als auch in seiner blockierten Position an der Verbindungsstelle zwischen einzelsträngiger und doppelsträngiger DNA.

Dies ergab, dass die Kontakte, die D2-I mit dieser einzelsträngigen-doppelsträngigen DNA-Verbindung herstellt, sich von den Kontakten unterscheiden, die es nur mit doppelsträngiger DNA herstellt.

Dadurch konnten sie einen bestimmten Abschnitt des FANCD2-Proteins identifizieren, die sogenannte „KR-Helix“, von der sie in ihren Einzelmolekül-Bildgebungsexperimenten zeigten, dass sie für das Erkennen von Lücken in der einzelsträngigen DNA und das Blockieren dieser entscheidend ist.

In Zusammenarbeit mit Guillaume Guilbaud und Julian Sale von der PNAC-Abteilung des LMB sowie Themos Liolios und Puck Knipscheer vom Hubrecht Institute in den Niederlanden zeigten sie außerdem, dass die Fähigkeit des D2-I-Komplexes, an diesen Verbindungen mithilfe der KR-Helix zu blockieren, für die DNA-Reparatur durch den FA-Signalweg von entscheidender Bedeutung ist.

Wenn sich DNA normalerweise in unseren Zellen repliziert, entpackt sie die beiden DNA-Stränge und kopiert jeden einzelnen Strang. Dadurch entsteht eine „Replikationsgabel“, an der die ursprünglichen DNA-Stränge entwickelst werden und an jedem Strang neue doppelsträngige DNA entsteht. Wenn diese Gabel jedoch eine DNA-Querverbindung erreicht, können die Stränge nicht entpackt werden, wodurch der normale DNA-Replikationsprozess zum Stillstand kommt.

Diese blockierte Replikationsgabel enthält somit freiliegende einzelsträngige Lücken, wo die DNA abgewickelt, aber nicht repliziert wurde. Diese Forschung hat gezeigt, dass es diese Verbindungen zwischen einzel- und doppelsträngiger DNA an der blockierten Replikationsgabel sind, an denen sich der D2-I-Proteinkomplex festklammert.

Dadurch kann der D2-I-Komplex nicht nur andere Proteine ​​des FA-Signalwegs zur DNA-Vernetzung bringen, um die Reparatur einzuleiten, sondern er verankert auch die verbleibende doppelsträngige DNA und schützt die blockierte „Replikationsgabel“ vor Enzymen in der Zelle, die das freiliegende Ende des DNA-Strangs zerfressen und die DNA weiter schädigen würden.

Diese Arbeit hat gezeigt, dass es die DNA-Strukturen innerhalb der Replikationsgabel sind, die aufgrund der quervernetzten DNA ins Stocken geraten, und nicht die quervernetzte DNA selbst, die den D2-I-Komplex dazu veranlassen, nicht mehr zu gleiten und sich an die DNA zu klammern, um die Reparatur einzuleiten. Diese ins Stocken geratenen Replikationsgabeln treten bei vielen Arten von DNA-Schäden auf, was die breite Rolle des D2-I-Komplexes bei anderen Formen der DNA-Reparatur sowie über den FA-Pfad erklärt.

Das Verständnis des Prozesses der DNA-Reparatur und vor allem der Gründe, warum er fehlschlägt, ist von enormer Bedeutung, da DNA-Schäden ein Schlüsselfaktor bei vielen Krankheiten sind. Entscheidend ist, dass viele Krebsmedikamente, beispielsweise Cisplatin, so schwere Zellschäden an Krebszellen verursachen, dass diese aufhören, sich zu teilen und absterben.

In solchen Fällen können DNA-Reparaturprozesse – ein so wichtiger physiologischer Prozess im normalen Leben – von Krebszellen gekapert werden, die sie nutzen, um sich gegen die Wirkung von Chemotherapeutika zu wehren. Das Verständnis der mechanistischen Grundlagen des ersten Schritts im DNA-Reparaturprozess könnte zu Möglichkeiten führen, Patienten zu sensibilisieren, damit Krebsmedikamente in Zukunft wirksamer sein können.