Wissenschaftler bringen die Sequenzierung einzelner DNA-Moleküle auf die nächste Ebene

In den letzten Jahren haben Technologien, die es Wissenschaftlern ermöglichen, die DNA einer Person mit Einzelmolekülauflösung zu untersuchen, unser Wissen über das menschliche Genom, das Mikrobiom und die genetischen Grundlagen von Krankheiten enorm erweitert. Mit einer so detaillierten Ansicht der DNA ist es möglich, genetische Varianten und strukturelle Details zu erkennen, die mit früheren Sequenzierungstechnologien einfach nicht erkennbar waren.

Die heutigen Goldstandardmethoden für die Einzelmolekülanalyse erfordern jedoch typischerweise mindestens 150.000 menschliche Zellen – die Millionen einzelner DNA-Moleküle enthalten. Das bedeutet, dass Forscher diese Werkzeuge nicht anwenden können, wenn nur ein paar Tausend Zellen verfügbar sind, wie dies bei vielen Tumorbiopsien der Fall ist. Dies begrenzt das wissenschaftliche und klinische Potenzial dieser Technologien.

Nun haben Forscher am Gladstone Institute zwei neue Werkzeuge für die Einzelmolekülanalyse entwickelt, die die benötigte DNA-Menge um 90 bis 95 % reduzieren. Ihre Arbeit, veröffentlicht im Journal Naturgenetikzeigt, wie Wissenschaftler mithilfe dieser Werkzeuge biologische Fragen angehen können, für die sie bisher keine Antwort hatten.

„Wir haben sehr lange an der Entwicklung dieser Methoden gearbeitet“, sagt Vijay Ramani, Ph.D., Assistenzforscher bei Gladstone und Hauptautor der Studie. „Wir sind wirklich gespannt, welche Entdeckungen nun möglich sein werden.“

DNA markieren für einen klareren Blick

Das erste der neuen Tools, bekannt als „Einzelmolekül-Echtzeitsequenzierung durch Tagmentation“ oder SMRT-Tag, erweitert die etablierten Protokolle zur gleichzeitigen Kartierung der Basensequenz in einem langen DNA-Fragment und der Positionen chemischer Strukturen, sogenannter Methylgruppen, die entlang der Länge der DNA verlaufen. Methylgruppen spielen eine Schlüsselrolle bei der Genexpression und sind daher für das Verständnis von Krankheiten unverzichtbar. Daher ist es wichtig zu sehen, wie sie auf der DNA angeordnet sind.

„Wenn wir nur sehr wenig DNA haben, mit der wir arbeiten können, können wir nicht einfach weitere Kopien der DNA anfertigen und unsere üblichen Protokolle anwenden“, sagt Ramani. „Durch das Anfertigen von Kopien würden diese Methylierungsmuster verloren gehen und andere Fehler eingeführt werden.“

Stattdessen entwickelte sein Team einen Ansatz namens „Tagmentation“, bei dem das Bakterienprotein Tn5 dazu genutzt wird, DNA-Moleküle gleichzeitig in besser handhabbare Fragmente zu schneiden und sie mit den für die weitere Analyse notwendigen chemischen Komponenten zu markieren.

Tagmentation wird bereits zur Sequenzierung kurzer DNA-Fragmente verwendet, wenn nur kleine Mengen DNA zur Verfügung stehen. Aus den kurzen Fragmenten lassen sich jedoch nur begrenzte Informationen gewinnen.

Die Herausforderung für Ramanis Team bestand darin, die Biochemie der Tagmentierung so zu gestalten, dass kleine DNA-Mengen in lange Stücke von etwa 3.000 bis 5.000 Basenpaaren zerlegt werden können. Ihre Methode „markiert“ die Enden jedes Fragments mit haarnadelförmigen Strukturen, wodurch lange DNA-Schleifen entstehen, die von Sequenziergeräten zuverlässig gelesen werden können.

„Das war eine ziemlich heroische Leistung der Mitarbeiter und Studenten in meinem Labor“, sagt Ramani. „Wir mussten verschiedene Versionen von Tn5 und fast 100 verschiedene Bedingungen mit unterschiedlichen Puffern, Enzymen und Temperaturen testen. Wenn man mit so kleinen DNA-Mengen arbeitet, ist jedes Problem, das zu einem DNA-Verlust führt, ein noch größeres Problem.“

Verwertbare Daten aus kleinen Stichproben

Nachdem das Team SMRT-Tag optimiert hatte, konnte es nachweisen, dass es genauso gut funktioniert wie etablierte Protokolle, allerdings mit weitaus geringeren DNA-Mengen – etwa der Menge, die in nur 10.000 Zellen vorkommt.

„Mithilfe der Goldstandard-Sequenzierungsmaschinerie für Einzelmoleküle hat noch nie jemand eine so kleine Menge DNA mit der Abdeckung sequenziert, die wir jetzt erreicht haben“, sagt Ramani.

Als nächstes kombinierte sein Team SMRT-Tag mit einer zuvor entwickelten Methode namens SAMOSA, die Abkürzung für „Single-Molecule Adenine Methylated Oligonucleosome Sequencing Assay“.

SAMOSA deckt zusätzliche Methylierungsmuster auf, die die Zugänglichkeit des Chromatins widerspiegeln – oder wie leicht die Genexpressionseinheit auf unterschiedliche DNA-Abschnitte zugreifen kann.

Mit dem neuen SAMOSA-Tag-Tool konnten die Forscher nun die Chromatinzugänglichkeit mit viel weniger DNA als bisher beurteilen. Zur Demonstration verwendeten sie das Tool auf Prostatakrebszellen – einige davon aus dem ursprünglichen Tumor eines Patienten und einige aus einem Tumor, der sich an eine andere Stelle im Körper ausgebreitet hatte –, die transplantiert und in Mäusen gezüchtet worden waren. Die Methode offenbarte Unterschiede in der Chromatinzugänglichkeit, die auf mögliche Schlüsselfaktoren für die Metastasierung von Krebs hinweisen.

„Dies ist nur ein Beispiel dafür, wie unsere Werkzeuge auf klinisch relevante Proben bei Krebs und anderen Krankheiten angewendet werden könnten, bei denen DNA knapp ist“, sagt Dr. Siva Kasinathan, der die Studie gemeinsam mit Ramani leitete. „Wir glauben, dass hier einige leicht zu erreichende Ziele zu finden sind, die neue biologische Erkenntnisse erschließen könnten, die für die spätere Behandlung von Patienten wichtig sein könnten.“

Kasinathan, ein klinischer Mitarbeiter am Lucille Packard Children’s Hospital der Stanford University, ist Gastwissenschaftler in Gladstone und arbeitet seit langem mit Ramani zusammen.

Ramanis Team optimiert derzeit SMRT-Tag und SAMOSA-Tag, um mit noch kleineren DNA-Mengen arbeiten zu können. Außerdem teilen sie ihre Protokolle weiterhin online und aktualisieren sie regelmäßig, um Feedback und Mitarbeit anderer Forscher zu ermöglichen. „Die Community und die beteiligten Personen sind für die Geschichte dieser Arbeit wirklich wichtig“, sagt Ramani.

Insbesondere hebt er seine Arbeit mit Kasinathan hervor, den er während seines gemeinsamen Studiums an der University of Washington kennenlernte. Gemeinsam konzipierten sie die Studie. „Es war so bedeutsam, mit einem meiner engsten Freunde zusammenzuarbeiten und eine Arbeit zu veröffentlichen, die unserer Meinung nach große Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben wird.“