Als Steve Carr, Senior Director der Proteomics Platform am Broad Institute des MIT und Harvard, mit seiner Arbeit in der Proteomik begann, konnte man in diesem Bereich nur die am häufigsten vorkommenden Proteine in einer bestimmten Probe nachweisen. In den letzten Jahren haben immer empfindlichere Massenspektrometer den Weg für enorme Fortschritte geebnet: Wissenschaftler sind heute in der Lage, nahezu alle Proteine in einer Probe nachzuweisen und zu analysieren, auch solche, die nur in winzigen Mengen vorhanden sind.
Jüngste Verbesserungen bei der Probenhandhabung und der Empfindlichkeit von Massenspektrometern ermöglichen nun weitere Fortschritte in Form von Einzelzell- und räumlichen Proteomik-Technologien. Diese Methoden können Proteine in einzelnen Zellen statt in Gewebemassen identifizieren und die Position bestimmter Proteine innerhalb eines Gewebes kartieren, sodass Wissenschaftler mehr Details über die Funktionsweise und Kommunikation von Zellen erfahren können. Dieser Fortschritt ist zum Teil auf optimierte Methoden und leistungsfähigere Werkzeuge zurückzuführen, die von Forschern wie Claudia Ctortecka, einer Postdoktorandin der von Carr geleiteten Proteomik-Plattform, und ihren Kollegen auf der Plattform entwickelt wurden.
Carr und Ctortecka suchen nach Kooperationsmöglichkeiten, um neue Einzelzell- und räumliche Proteomik-Technologien auf immer komplexere Fragen anzuwenden. Sie hoffen, die Technologie weiter voranzubringen und sie in Kombination mit Werkzeugen aus anderen Bereichen einzusetzen, um mehr über die gesamte Bandbreite zellulärer Aktivität zu erfahren, von der Genexpression bis hin zu posttranslationalen Modifikationen.
Wir sprachen mit Carr und Ctortecka über das Potenzial der räumlichen und Einzelzell-Proteomik und ihre Hoffnungen für zukünftige Kooperationen.
Was kann die Einzelzell- und räumliche Proteomik heute ermöglichen?
Carr: In der Vergangenheit wurde in der Proteomik Massenmaterial verwendet – Proben bestehend aus Millionen von Zellen – die alle zusammen lysiert und dann auf der Ebene des Proteoms und der posttranslationalen Modifikation profiliert wurden. Dabei gingen Informationen über die Einzigartigkeit jeder einzelnen Zelle verloren und wir hatten nur begrenzte Informationen über die räumliche Heterogenität von Geweben, die bei Krankheiten eine entscheidende Rolle spielt.
Technologien zur Einzelzell-Proteomik mit einer Analysetiefe von Tausenden von Proteinen, die pro Zelle quantifiziert werden, sind erst seit kurzem verfügbar. Erst seit kurzem ist es auch möglich, räumliche Profilierungsmethoden zu entwickeln, die eine tiefgreifende, unvoreingenommene Proteomanalyse in definierten Geweberegionen ermöglichen.
Ctortecka: Früher in der Geschichte des Fachgebiets haben wir hauptsächlich die Zellidentität überwacht und nach den am häufigsten vorkommenden Proteinen gesucht, die den jeweiligen Zelltyp beschreiben. Jetzt werden wir immer sensibler. Wir können Subpopulationen eines bestimmten Zelltyps finden, der uns interessiert. Wir können Übergangszustände erkennen; wir können Zellen erkennen, die morphologisch sehr unterschiedlich sind. Und wir können daraus aussagekräftige biologische Informationen ableiten.
Wir sind jetzt auch in der Lage, Proteine besser und reproduzierbarer zu quantifizieren, was von entscheidender Bedeutung ist. Das Vorhandensein eines Proteins allein sagt nicht viel über den Zustand einer Zelle aus. Es kommt darauf an, wie viel von diesem Protein im Verhältnis zu seiner Umgebung vorhanden ist. Der relative Unterschied zwischen Zelle A und Zelle B könnte Ihnen eine Vorstellung davon geben, warum eine Zelle auf eine Behandlung reagiert und die andere nicht.
Welche komplexeren Fragen können Wissenschaftler mit diesen neuen Ansätzen stellen?
Carr: Zellen, die nahe beieinander liegen, kommunizieren miteinander. Zellen haben ein Sekretom: Sekrete von Zelle A lösen Phänomene in Zelle B aus. Um das zu untersuchen, müssen wir in der Lage sein, einzelne Zellen zu betrachten, und wir brauchen räumliche Informationen über sie. Wir möchten untersuchen, wie das, was in Zellpopulationen in einem Bereich eines Gewebes passiert, eine Zellpopulation in einem anderen Bereich desselben Gewebes beeinflusst.
Ctortecka: Bei der räumlichen Auflösung betrachten wir mehrere Zellen im Kontext. Wir können beginnen, uns auf Zellen zu konzentrieren, die ähnlich aussehen, die sich neben etwas Interessantem befinden oder die Teil eines interessanten Gewebes sind. Das hilft uns, die Signalübertragung innerhalb eines Gewebes zu verstehen und welche Rolle Unterschiede in der Proteinhäufigkeit dabei spielen. Wir können beispielsweise beginnen, zu extrapolieren, warum manche Patienten resistenter oder empfindlicher gegenüber einer Behandlung sind.
Die Einzelzellgenomik hat unser Verständnis davon, wie Zellen in gesundem und krankem Zustand funktionieren, grundlegend verändert. Glauben Sie, dass die Einzelzell- und räumliche Proteomik eine ähnliche Wirkung haben werden?
Ctortecka: Die Proteomik war schon immer ein ergänzender Ansatz zu anderen -omik-Strategien, und ich glaube, das wird auch diesmal so bleiben. Die Genom- oder Transkriptomik-Informationen, die wir aus Tausenden von Zellen eines Gewebes gewinnen können, liefern unschätzbare Erkenntnisse über das Vorhandensein von Subpopulationen und möglicherweise ihre Identitätsmerkmale.
Mit der Fähigkeit, diese Subpopulationen mittels Fluoreszenzsortierung oder Laser-Mikrodissektion auszuwählen, können wir ihr Proteom mit hoher Auflösung profilieren und so eine weitere Informationsebene gewinnen. Die Proteomik kann derzeit nicht mit dem Durchsatz von Sequenzierungsstrategien mithalten, aber ich bin überzeugt, dass Informationen über einzelne Zellen und räumliche Proteomik ihren Weg in die Klinik finden und uns helfen werden, das fehlende Puzzlestück zu liefern, um zu verstehen, wie Zellen tatsächlich Entscheidungen treffen.
Nach welchen Arten von Kooperationen suchen Sie und was ist ein Beispiel für eine aktuelle Kooperation?
Ctortecka: Wir möchten der Broad-Community zeigen, was wir können, und wir möchten von der Broad-Community hören, was sie wissen möchte. Wir sind wirklich daran interessiert, die Technologie weiterzuentwickeln, um biologische Fragen zu beantworten. Unseren Ansatz auf der Grundlage dieser biologischen Fragen anzupassen, ist etwas, das uns wirklich begeistert und etwas, worin wir immer besser werden.
Wir arbeiten beispielsweise in einer Kooperation mit Melina Claussnitzer an der zeitlichen Zelldifferenzierung. Wir haben eine Zellpopulation in einem sehr frühen Entwicklungsstadium, die in eine bestimmte Nische gedrängt wird, und können sie mit Einzelzellauflösung profilieren. Dies ist das erste Mal, dass dies auf Proteomebene durchgeführt wurde, und ohne unseren Kooperationspartner hätten wir diesen Ansatz nicht entwickeln können.
Carr: Wir lernen viel durch diese Zusammenarbeit. Es gibt immer noch Herausforderungen, aber wir sind jetzt an einem Punkt angelangt, an dem viele dieser Dinge keine physischen Barrieren mehr darstellen. Es sind technische Probleme, für die wir nur eine Lösung finden müssen.
Woran arbeiten Sie aktuell, um diese Technologien weiterzuentwickeln?
Ctortecka: Uns interessiert nicht nur die Proteinzusammensetzung einer Zelle, sondern auch die posttranslationalen Modifikationen auf der Ebene einzelner Zellen, weil diese möglicherweise aussagekräftiger für den Zustand einer Zelle sind und für die sub- und interzelluläre Signalübertragung von entscheidender Bedeutung sind.
Carr: Die Analyse von Proteinmodifikationen ist schon seit langem mein Interesse, und die Gruppe hat sich seit ihrer Gründung im Jahr 2004 auf diesen Bereich konzentriert. Wir haben globale Methoden zur Analyse einer breiten Palette posttranslationaler Modifikationen – einschließlich Phosphorylierung, Ubiquitinierung und Acetylierung – aus derselben Probe entwickelt, wobei wir serielle Anreicherungsstrategien anwenden. Die Anpassung dieser Methoden an räumliche oder Einzelzellproben ist eine unserer aktuellen Herausforderungen. In einer aktuellen Studie konnten wir erfolgreich eine breite Palette von Histonmodifikationen auf Einzelzellebene profilieren.
Eine unserer nächsten Herausforderungen ist die Untersuchung der Phosphorylierung und der Veränderungen in Signalwegen in bestimmten Bereichen des Tumorgewebes. Die Charakterisierung gut beschriebener funktioneller Phosphorylierungsmuster und der beteiligten Kinasen kann Einblicke in klinisch relevante Biologie liefern.
Ctortecka: Eine weitere Herausforderung ist die Entwicklung von Informatiksystemen, mit denen Proteine oder posttranslationale Modifikationen mit minimalem Probeneinsatz zuverlässig identifiziert und quantifiziert werden können. Die Interpretation der komplexen Daten, die wir mit unseren immer schnelleren und empfindlicheren Massenspektrometern generieren, erfordert viel Fachwissen, da Analysesoftware zunehmend auf maschinellem Lernen basiert. Anfangs wurde maschinelles Lernen verwendet, um zwischen echten und falschen positiven Ergebnissen zu unterscheiden. Heute verwenden wir es, um verschiedene Parameter vorherzusagen und zu bewerten, wie zuverlässig unsere Identifizierungen sind.
Carr: Die Fortschritte, die allein in den letzten Jahren im Bereich der Proteomik erzielt wurden, sind zwar erstaunlich, aber sie sind nur ein Vorspiel zu dem, was in den nächsten Jahren wahrscheinlich passieren wird.