Wesentlicher Prozess für die Virusreplikation von SARS-CoV-2 visualisiert

Bei der Replikation des SARS-CoV-2-Virus wird eine lange Kette verbundener Proteine ​​in einzelne Proteine ​​gespalten. Dieser Prozess wird durch ein von der FDA zugelassenes Medikament zur Behandlung von COVID-19 unterbrochen; Die mechanistischen Details dieses Spaltungsprozesses sind jedoch noch unklar. Nun hat ein von Forschern der Penn State geleitetes Team die bisher detailliertesten Bilder dieses Prozesses erstellt und dabei gezeigt, dass diese Proteine ​​in einer konsistenten Reihenfolge gespalten werden, die wahrscheinlich durch die Struktur der Proteinkette vorgegeben wird.

Die Ergebnisse wurden in einem Artikel veröffentlicht, der in der Zeitschrift für biologische Chemiekönnte die Entwicklung effizienterer Medikamente zur Behandlung von COVID-19 unterstützen.

Retroviren und viele andere RNA-Viren – einschließlich SARS-CoV-2 – übersetzen ihre RNA-Genome in eine lange Kette verbundener Proteine, die als Polyprotein bezeichnet werden. Dieses Polyprotein wird später durch ein Enzym namens Protease einzeln in einzelne, reife Proteine ​​gespalten.

Dieser Prozess ist ein wesentlicher Schritt bei der Virusreplikation und daher ein ideales Angriffsziel für antivirale Medikamente. Beispielsweise enthält das Medikament Paxlovid, das für den Notfalleinsatz zur Behandlung von leichtem bis mittelschwerem COVID-19 zugelassen ist, einen Proteasehemmer namens Nirmatrelvir, der diesen Prozess im SARS-CoV-2-Virus in infizierten menschlichen Zellen stört.

„Das SARS-COV-2-Virus verwendet eine Protease namens Mpro, um ein Polyprotein in einer bestimmten Reihenfolge in zehn einzelne Proteine ​​zu spalten“, sagte Katsuhiko Murakami, Professorin für Biochemie und Molekularbiologie an der Penn State und Autorin des Artikels.

„Aber wie diese Reihenfolge bestimmt wird, blieb unklar. Warum geht Mpro zuerst zu einer Erkennungsstelle und nicht zu den anderen? In dieser Studie haben wir Kryo-Elektronenmikroskopie verwendet, um hochauflösende 3D-Visualisierungen von Mpro allein und im Komplex mit dem Polyprotein zu erstellen.“ . Ein besseres Verständnis, wie dieser Spaltungsprozess abläuft, könnte Erkenntnisse zur Optimierung der Bindung eines antiviralen Arzneimittels liefern oder sogar neue Wege zur Hemmung des Prozesses aufzeigen.“

Frühere Studien verwendeten eine bildgebende Technik namens Röntgenkristallographie, um Mpro allein oder während es an einen sehr kurzen Abschnitt des Polyproteins gebunden ist, zu untersuchen. Das Forschungsteam wollte Mpro jedoch im Kontext untersuchen, mit einer viel repräsentativeren Form des Polyproteins und mit einer höheren Auflösung.

„Eine Einschränkung bei früheren Studien bestand darin, dass sie nur ein kleines Peptid zur Nachahmung des Polyproteins verwendeten“, sagte Manju Narwal, Postdoktorand an der Penn State und Erstautor der Arbeit. „Wir wollten einen klareren Überblick darüber, wie Mpro die verschiedenen Erkennungsstellen auf dem Polyprotein anspricht, um zu sehen, ob es etwas an Mpro oder dem Polyprotein gibt, das vorgibt, wohin es zuerst geht.“

Die Forscher fanden heraus, dass Mpro mit der Erkennungsstelle an der Spaltungsstelle assoziiert, aber nur sehr wenig Kontakt mit dem Rest des Polyproteins herstellt. Den Forschern zufolge deutet dies darauf hin, dass die Polyproteinstruktur möglicherweise vorgibt, welche Stelle Mpro zuerst spaltet.

„Wenn Mpro den Prozess vorantreiben und aus allen offengelegten Möglichkeiten eine bevorzugte Erkennungsstelle auswählen würde, würden wir aus Gründen der Energie und Stabilität erwarten, dass es zusätzliche Kontakte mit dem Polyprotein knüpft“, sagte Narwal.

„Da wir diese zusätzlichen Kontakte nicht sehen, vermuten wir, dass stattdessen die Struktur des Polyproteins die Spaltungsreihenfolge vorgibt. Beispielsweise ist möglicherweise nur eine begrenzte Anzahl von Erkennungsstellen innerhalb des Polyproteins für Mpro zugänglich. Wenn das erste Protein gespalten wird Mpro und trennt sich vom Rest des Polyproteins, die nächste bevorzugte Stelle wird freigelegt. Sobald diese abgespalten ist, wird eine andere freigelegt und so weiter.“

Diese neuen Erkenntnisse waren möglich, weil die Forscher Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) verwendeten, eine bildgebende Technik, die biomolekulare Strukturen mit atomarer Auflösung erzeugt.

„Aufgrund der Bedeutung von Mpro erstellten Forscher auf der ganzen Welt schnell Hunderte von Bildern der Protease mithilfe der Röntgenkristallographie, die sich gut zur Untersuchung der Strukturen kleinerer Ziele eignet“, sagte Jean-Paul Armache, Assistenzprofessor für Biochemie und Molekularbiologie an der Penn State University und Autor des Artikels.

„Kryo-EM ist eine Technik, die häufiger bei größeren Molekülen angewendet wird, aber Mpro ist, selbst wenn es an das Polyprotein gebunden ist, immer noch recht klein, was es schwieriger machen kann, die Struktur mit hoher Auflösung zu bestimmen. Trotz der geringen Größe waren wir dabei.“ Dank einer Kombination aus Manjus sorgfältiger Probenvorbereitung, den Fähigkeiten unseres Kryo-EM-Mikroskopisten und Co-Autors Thomas Edwards und modernen Datenverarbeitungstechniken konnte ich mich mithilfe von Kryo-EM auf Mpro konzentrieren.“

Das Forschungsteam führte seine ersten Experimente mit Instrumenten in der Kryo-EM-Einrichtung des Penn State Huck Institutes of the Life Sciences durch und führte anschließend weitere Bildgebungsuntersuchungen in der National Cryo-EM-Einrichtung des National Cancer Institute in Frederick, Maryland durch.

„Obwohl wir ein klares Bild von Mpro ermittelten, wenn es an das Polyprotein gebunden war, war das Bild des Polyproteins selbst weniger klar“, sagte Murakami. „Wir arbeiten daran, den gesamten Komplex zu visualisieren und uns auf andere Regionen des Polyproteins zu konzentrieren. Diese Erkenntnisse werden die zukünftige Forschung zu diesem entscheidenden Schritt bei der Replikation vieler Viren unterstützen und, so hoffen wir, letztendlich die Entwicklung effizienter neuer antiviraler Medikamente unterstützen.“ Drogen.“