Weiterentwicklung synthetischer Ephedra-Alkaloide durch einen zweistufigen enzymatischen Ansatz

Ephedra-artige Alkaloide, eine Klasse natürlich vorkommender Verbindungen, die aus Pflanzen der Gattung Ephedra gewonnen werden, sind aufgrund ihrer stimulierenden und atemwegserweiternden Wirkung seit langem in der Pharmaindustrie von Interesse. Diese Alkaloide werden zur Behandlung von Erkrankungen wie Asthma und niedrigem Blutdruck eingesetzt.

Während diese Alkaloide traditionell aus Pflanzen extrahiert werden, besteht ein zunehmendes Interesse an synthetischen Versionen, die verbesserte Eigenschaften und weniger Nebenwirkungen bieten. Synthetische Alkaloide mit Modifikationen am Phenylring und der N-Gruppe haben verbesserte pharmakologische Wirkungen gezeigt. Die derzeitigen chemischen Synthesemethoden sind jedoch umweltschädlich und in ihrer Reichweite begrenzt.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, versuchte eine Gruppe von Forschern der Universität Xiamen in China unter der Leitung von Professor Jifeng Yuan, einen effizienteren zweistufigen enzymatischen Ansatz zur Synthese von Ephedra-artigen Alkaloiden zu entwickeln. Dem Team gelang die Synthese verschiedener Ephedra-artiger Alkaloide mit verbesserten Erträgen und die Einführung neuer N-Gruppen-Modifikationen.

Der neue Ansatz erhöht die strukturelle Vielfalt synthetischer Ephedra-Alkaloide und könnte zu neuen Arzneimittelkandidaten mit breiteren pharmazeutischen Anwendungen führen. Ihre Studie wurde veröffentlicht In BioDesign Forschung am 3. September 2024

Zunächst suchten die Forscher nach geeigneten Enzymen für den Syntheseprozess. Dabei stellten sie fest, dass die Acetolactat-Synthase aus Bacillus subtilis (BsAlsS) eine überlegene Fähigkeit zur Carboligation aufweist.

Bei der Carboligation werden aromatische Aldehyde mit Pyruvat kondensiert, um α-Hydroxyketone zu bilden, die wichtige Zwischenprodukte bei der Alkaloidsynthese sind. Die Wirksamkeit dieses Enzyms bei der Carboligation war entscheidend für die Erzeugung einer Reihe von α-Hydroxyketonen der Phenylacetylcarbinol-Klasse (PAC).

Anschließend führten sie Computersimulationen durch, um BSAlsS mit dem gut charakterisierten Enzym EcIlvBN von Escherichia coli zu vergleichen. Diese Simulationen konzentrierten sich auf die Ermittlung der Substratbindungsstellen und katalytischen Rückstände des Enzyms.

„Wir haben die Aktivität von BsAlsS mit Benzaldehyd (BAL) und 4-Hydroxybenzaldehyd (4-HBAL) getestet, wobei wir sowohl gereinigte Enzympräparate als auch Ganzzell-Biokatalysatoren verwendet haben. Nachdem wir die ersten Ergebnisse bestätigt hatten, haben wir unsere Tests auf eine Vielzahl substituierter aromatischer Aldehyde ausgeweitet“, erklärt Prof. Yuan.

Das Team untersuchte Substrate mit unterschiedlichen Substitutionen, wie Hydroxy-, Methoxy- und Halogengruppen, um zu sehen, wie gut sie sich in α-Hydroxyketone umwandeln ließen. Die Effizienz dieser Reaktionen wurde durch Berechnung der Umwandlungsraten und Validierung der Produkte mithilfe einer wissenschaftlichen Instrumentierungstechnik namens Massenspektrometrie beurteilt.

Darüber hinaus untersuchten sie mehrere Iminreduktasen (IREDs), um ihre Fähigkeit zur reduktiven N-Alkylaminierung (Einführung von Alkylgruppen in ein Amin) von α-Hydroxyketonen zu testen. Zu den IREDs gehörten AspRedAmQ240A von Aspergillus oryzae, IR77A208N von Ensifer adhaerens und IRG02 von Streptomyces albidoflavus. Die Enzymaktivitäten wurden durch Testen verschiedener Aminpartner und Messen der Umwandlung von PAC in sekundäre Amine bewertet.

Das Verhältnis der Aminäquivalente wurde optimiert, um die Umwandlungsraten zu verbessern, und das Potenzial von IREDs zur Erzeugung verschiedener synthetischer Ephedra-artiger Alkaloide wurde untersucht. Darüber hinaus entwickelten sie ein Eintopf-Biokatalysesystem zur Integration von BsAlsS und IRG02 für eine optimierte Synthese von Ephedra-artigen Alkaloiden. Bei diesem Ansatz wurden Carboligations- und reduktive Aminierungsreaktionen nacheinander im selben Gefäß durchgeführt. Die Effizienz dieser Methode wurde mit herkömmlichen zweistufigen Prozessen verglichen.

Computersimulationen zeigten, dass BsAlsS eine ähnliche Substratbindungsstelle wie EcIlvBN hat, was auf sein Potenzial für Carboligationsreaktionen hinweist. Versuchsergebnisse bestätigten, dass BsAlsS Benzaldehyd und 4-Hydroxybenzaldehyd effektiv in PAC bzw. 4-Hydroxy-PAC umwandelte und so die Aktivität von EcIlvBN zunichtemachte. Ganzzell-Biokatalysatoren von BsAlsS zeigten im Vergleich zu gereinigten Enzympräparaten eine gleiche oder bessere katalytische Aktivität, mit etwas höherer Effizienz für Benzaldehyd.

BsAlsS erwies sich als vielseitige Carboligase und erreichte eine nahezu 100-prozentige Umwandlung verschiedener aromatischer Aldehyde, darunter auch solcher mit Hydroxyl-, Methoxy- und Halogensubstitutionen. Substrate mit Fluorsubstitutionen zeigten eine höhere Aktivität als solche mit Chlor oder Brom, und para-substituierte Aldehyde lieferten im Allgemeinen bessere Ergebnisse als ortho-substituierte.

Unter den getesteten IREDs zeigte IRG02 eine überlegene Aktivität bei der Umwandlung von PAC in sekundäre Amine mit verschiedenen Aminpartnern. Unter optimierten Bedingungen wurden hohe Umwandlungsraten für Propargylamin und Cyclopropylamin erreicht, wobei eine Umwandlung von bis zu 91 % erreicht wurde. IR77A208N zeigte ebenfalls eine gute Leistung, insbesondere mit Ammoniak.

Zusammenfassend wurden Ephedra-artige Alkaloide mit akzeptablen Umsätzen erfolgreich mit dem sequentiellen biokatalytischen Eintopfverfahren synthetisiert. Diese Strategie ermöglichte eine effiziente Integration der Schritte Carboligation und reduktive Aminierung, obwohl direkte parallele Eintopfreaktionen aufgrund der Bildung von Nebenprodukten zu suboptimalen Ausbeuten führten.

Die Ergebnisse dieser Studie sind für die Pharmaindustrie sehr vielversprechend. Prof. Yuan erläutert dies weiter und äußert sich optimistisch: „Die erfolgreiche Synthese neuer Ephedra-artiger Alkaloide mithilfe von IREDs eröffnet die Möglichkeit, vielfältigere und effizientere Methoden zur Arzneimittelproduktion zu entwickeln. Insbesondere die in dieser Studie hergestellten, mit Propargylamin modifizierten Alkaloide bieten Potenzial für eine weitere chemische Diversifizierung, die zur Entdeckung neuer therapeutischer Verbindungen führen könnte.“

In Zukunft planen die Forscher, ihre Methoden weiter zu verfeinern und die strukturelle Vielfalt synthetischer Alkaloide durch Enzym-Engineering zu erweitern, um einer effizienteren und zugänglicheren Arzneimittelentwicklung näher zu kommen.