Verwendung von Nanoporen zur schnelleren Erkennung epigenetischer Veränderungen

Veränderungen, die als epigenetische Modifikationen bekannt sind, spielen eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung. Diese schnell und zuverlässig analysieren zu können, könnte wesentlich zur Weiterentwicklung der personalisierten Therapie beitragen. Einem Forscherteam vom Institut für Physiologie der Universität Freiburg ist es nun gelungen, die für epigenetische Modifikationen typischen chemischen Veränderungen in Proteinen mittels Nanoporenanalyse zu charakterisieren. Ihre Forschungsergebnisse haben die Forscher im veröffentlicht Zeitschrift der American Chemical Society (JACS).

Nanoporen haben sich in den letzten Jahren zu einem breit anwendbaren Werkzeug für die Analyse von Molekülen entwickelt. Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften ermöglichen sie die Analyse der Struktur von Molekülen in Sekundenbruchteilen: Als zylindrisch angeordnete Proteine ​​bilden Nanoporen winzige Kanäle von nur wenigen millionstel Millimetern (Nanometer) Durchmesser, die in Biomembranen eingebettet werden können.

„Für die Experimente legen wir eine konstante Spannung über die Membran, sodass Ionen aus dem umgebenden Medium durch die Pore strömen. Dadurch entsteht ein konstanter, genau messbarer elektrischer Strom“, erklärt Prof. Dr. Jan C. Behrends von der Medizinischen Fakultät an der Universität Freiburg, in deren Labor die nun veröffentlichten Experimente stattfanden. Wandert jedoch ein Molekül in die Pore, wird der Strom blockiert: Je größer das Molekül, desto stärker wird es auch blockiert.

Ein Protein im Fokus der Forschung: H4

Im Rahmen der jetzt veröffentlichten Experimente widmeten sich die Freiburger Wissenschaftler der Untersuchung des sogenannten Histonproteins H4. Dieses Protein ist in allen Zellen mit Zellkern fest mit der DNA assoziiert und eines der am besten erforschten Angriffspunkte epigenetischer Modifikationen. Von diesen Modifikationen ist insbesondere eine Region am N-terminalen Ende des Proteins betroffen.

„Die dortige Proteinsequenz enthält mehrfach die Aminosäure Lysin“, erklärt Behrends. An diese Lysine, die entsprechend ihrer Position in der Proteinkette als K8, K12 und K16 bezeichnet werden, können im Rahmen epigenetischer Modifikationen beispielsweise Acetyl- oder Methylgruppen angebracht werden. Welche chemische Modifikation an welcher Lysin-Position stattfindet, ist durchaus von medizinischer Bedeutung, wie der Freiburger Physiologe betont. „Die Acetylierung an K16 zum Beispiel ist wichtig für die menschliche Entwicklung, während die Methylierung an K12 eine Rolle bei der Entstehung einiger Prostata- und Lungentumore spielt, so die neuesten Ergebnisse des Universitätsklinikums Freiburg.“

Veränderungen erkennen mit Hilfe einer Nanopore

In ihren Experimenten konnten Behrends und sein Team nun H4-Fragmente mit oder ohne Acetylierung sowie Fragmente mit einer, zwei oder drei Acetylierungen eindeutig unterscheiden. Außerdem konnten sie zeigen, dass die von ihnen verwendete Nanopore auch empfindlich auf den Ort der Acetylierung reagiert: Histonfragmente mit einer Acetylgruppe an K8 blockierten den Strom durch die Pore stärker als solche mit einer Acetylgruppe an K12, und diese wiederum stärker als solche mit eine K16-Acetylierung.

„Diese Empfindlichkeit ist insofern überraschend, als diese Bruchstücke in Masse und Gesamtvolumen identisch sind“, sagt Behrends. Der Porenstrom scheint also nicht nur von der Größe, sondern auch von der Form des Moleküls abhängig zu sein. Auch die unterschiedlichen Varianten doppelt acetylierter Histonfragmente – K8 und K12, K8 und K16 sowie K12 und K16 – ließen sich trotz identischer Masse wieder gut unterscheiden. Unterschiedlich stark und an unterschiedlichen Positionen methylierte H4-Fragmente blockierten den Strom durch die Pore ebenfalls unterschiedlich stark, wenn auch nicht so deutlich wie die acetylierten Varianten.

„Wir konnten durch unsere Experimente erstmals zeigen, dass wir mit der Nanoporenanalytik Moleküle nicht nur anhand ihrer Größe, sondern auch anhand ihrer Form unterscheiden können“, sagt Studienleiterin Behrends. Molekulardynamik-Simulationen der ebenfalls an der Studie beteiligten Forschungsgruppe um Aleksei Aksimentiev von der University of Illinois in den USA zeigen, dass ein stark inhomogenes elektrisches Feld innerhalb der Pore eine Schlüsselrolle für diesen Effekt spielt.

Zukunftsvision: Optimierte medizinische Diagnostik

Während die DNA-Sequenzierung mit Nanoporen bereits etabliert und kommerzialisiert ist, steht die Entwicklung der Nanoporen-basierten Analyse von Proteinen noch am Anfang, sagt Behrends. „Die Schwierigkeit bei der Sequenzierung von Proteinen besteht darin, dass es sich um Moleküle mit sehr uneinheitlichen Ladungsmustern handelt.“ Während DNA, die negativ geladen ist, im elektrischen Feld gerichtet wandert und so Base für Base durch die Pore gezogen werden kann, bestehen Proteine ​​aus Bausteinen aus unterschiedlich geladenen Aminosäuren. Dadurch ist eine gerichtete Bewegung im elektrischen Feld und ein „Scannen“ von Aminosäure für Aminosäure nicht möglich. Die Freiburger Wissenschaftler setzten daher bei ihren Experimenten auf einen anderen Ansatz. Statt einer Pore mit kurzer Verengung, wie sie bei der DNA-Sequenzierung verwendet wird, verwendeten sie eine maßgeschneiderte Pore mit einer Art molekularer Falle. „So konnte das gesamte Proteinfragment auf einmal erfasst werden“, sagt Behrends.

Bis zu welcher Fragmentgröße diese Art der Analyse eingesetzt werden kann, ist noch nicht klar. Zusätzliche Experimente zeigen jedoch, dass sich die Methode auch für die Analyse der bisher in der epigenetischen Forschung verwendeten H4-Fragmente eignen wird. Diese enthalten 14 statt der hier verwendeten zehn Aminosäuren und werden derzeit mit der sehr aufwendigen Tandem-Massenspektrometrie auf epigenetische Modifikationen untersucht. Die Forscher hoffen, dass die Analyse durch die Nanoporen wesentlich einfacher, schneller und kostengünstiger wird und nah am Patienten durchgeführt werden kann.

Die Weiterentwicklung der Nanoporenanalyse von Proteinen für die medizinische Diagnostik und deren Umsetzung in konkrete Produkte und Dienstleistungen ist auch eines der zentralen Projekte des kürzlich bewilligten BMBF-Clusters4Future nanodiagBW, das Behrends gemeinsam mit Prof. Dr. Felix von Stetten von der Hahn- Schickard-Gesellschaft, die für dieses Projekt federführend ist.