Verständnis des Umweltmikrobioms mit konfokaler Mikroskopie

Die konfokale Technologie ist einer der wichtigsten Fortschritte in der optischen Mikroskopie, und viele Disziplinen innerhalb von Texas A&M AgriLife und anderen Teilen des Texas A&M University System entdecken, dass sie auch in ihrer Forschung ein Wendepunkt sein kann.

Brian Shaw, Ph.D., Professor in der Abteilung für Pflanzenpathologie und Mikrobiologie, PLPM, am Texas A&M College of Agriculture and Life Sciences, ist Experte für konfokale Mikroskopie. Er wendet diese hochmoderne Technologie nicht nur in seiner eigenen Forschung an, sondern ermutigt auch Studenten und Doktoranden sowie andere Forscher, sie zu nutzen, um ihre eigenen wissenschaftlichen Bemühungen voranzutreiben.

Was ist konfokale Mikroskopie?

„Die konfokale Mikroskopie bietet mehrere Vorteile gegenüber der herkömmlichen Mikroskopie, darunter die Möglichkeit, die Schärfentiefe zu steuern und unscharfes Licht bei der Bilderzeugung auf der Fokusebene zu reduzieren oder zu eliminieren“, erklärt Shaw.

„Es gibt Ihnen auch die Möglichkeit, mit lebenden Zellen zu arbeiten und die Änderungen, die sie vornehmen, in Echtzeit zu sehen, sowie Serienschnitte von dicken Proben zu sammeln“, sagte er. „Außerdem kann es ein fast 3D-Bild der Zelle erzeugen, sodass Sie es aus verschiedenen Perspektiven betrachten können.“

Shaws primäres konfokales Mikroskop, das eine breite Palette von Bildgebungsmodalitäten ermöglicht, befindet sich im Gebäude für Pflanzenpathologie und Mikrobiologie auf dem Texas A&M-Campus.

Es handelt sich um ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop FV3000 von Olympus mit vier Detektoren und sechs Laserlinien, die die gleichzeitige Abbildung von Vierfarbkanälen fast aller Fluorophore ermöglichen. Es ist voll motorisiert mit Autofokus und ermöglicht stundenlange Aufnahmen im Zeitraffer, ohne den Fokus zu verlieren. Der motorisierte Präzisionstisch des Mikroskops ermöglicht gleichzeitige Mehrpunkt-Zeitrafferaufnahmen verschiedener Proben.

Konfokale Mikroskopie und Bestimmung pathogener Infektionen

Nach Recherchen in der Multidisziplinäre Zeitschrift für mikrobielle Ökologie, dem offiziellen Journal der International Society for Microbial Ecology, werden mehr als 80 % der Pflanzenkrankheiten durch Pilze oder pilzähnliche Krankheitserreger verursacht. Diese Krankheiten führen zu Ernteverlusten in Milliardenhöhe und bedrohen die Ernährungssicherheit.

Shaw sagte, ein Großteil der Forschung, die er und sein Team durchführen, beziehe sich auf die Bestimmung der zellulären Maschinerie, die am Wachstum und der Entwicklung von Pilzen beteiligt ist, und wie Pilzpathogene funktionieren.

„Wir untersuchen die Oberflächeneigenschaften von Pilzsporen und wie sie die Sporenausbreitung beeinflussen“, sagte er. „Die Pilzspore ist die ruhende Zelle, die diese Organismen verwenden, um sich über Entfernungen und im Laufe der Zeit zu verbreiten.“

Shaw sagte, dass Pilze ein polarisiertes Hyphenwachstum benötigen, um Auswirkungen auf Pflanzen und Menschen zu haben, daher ist es ein grundlegendes Anliegen zu verstehen, wie Hyphen hergestellt werden. Eine Hyphe ist die Grundeinheit eines Fadenpilzes und besteht typischerweise aus einer Kette länglicher Zellen, die sich an der Spitze der Spitzenzelle ausdehnen. Die länglichen, fadenförmigen Zellen wachsen nur an ihrer stark polarisierten Spitze und ihr Wachstum ist durch die anfängliche Etablierung einer Wachstumsstelle gekennzeichnet, der ihre kontinuierliche Aufrechterhaltung folgt.

„Unser Labor untersucht die zeitliche und räumliche Dynamik von Komponenten des Zytoskeletts während des Wachstums und der Entwicklung von Pilzhyphen“, sagte er. „Unter Verwendung des konfokalen Mikroskops haben wir festgestellt, dass die Sporen des wichtigen Mais-Pathogens Colletotrichum graminicola asymmetrisch sind. Und diese Sporen können sich nur auf einer Seite der Spore an ihren neuen Wirt anheften.“

Shaw sagte, da die Bindung an ihren neuen Wirt notwendig ist, um den Krankheitszyklus bei Mais zu beginnen, identifiziert diese Entdeckung ein neues und wesentliches Ziel, um Pilzkrankheiten bei Mais zu unterbinden.

„Mit Hilfe dieser höher aufgelösten, fast 3D-Bilder konnten wir auf eine Korrelation zwischen dem Ort der Anheftung und dem Ort der Infektion durch den Pilzerreger schließen“, sagte er. „Die konfokale Mikroskopie ermöglicht es uns, diese Strukturen und ihre Bestandteile in einer bisher nicht verfügbaren Detailgenauigkeit zu sehen. Jetzt können wir uns ein besseres Bild davon machen, wie Pilze wachsen, und die Hyphen bestimmter Pilze und ihre Rolle bei der Krankheitsentstehung identifizieren.“

Anwendung der konfokalen Mikroskopie im Grund- und Hauptstudium

Oli Bedsole, ein Doktorand in der Abteilung für Pflanzenpathologie und Mikrobiologie, der in Shaws Labor arbeitet, sagte, er verwende die konfokale Mikroskopie, um zu untersuchen, wie verschiedene Proteine ​​in Pilzen interagieren und sich assoziieren.

„Ich untersuche den Klebstoff in Pilzsporen, der es ihnen ermöglicht, sich an Pflanzen wie Mais anzuheften und diese später zu infizieren“, sagte Bedsole. „Die Auflösung eines Konfokalgeräts ist von größter Bedeutung und ermöglicht es mir zu sehen, wo sich der Klebstoff befindet, wo sich bestimmte Proteine ​​​​befinden und wie sie interagieren.“

Bedsole sagte, er habe die Grundlagen der konfokalen Mikroskopie von Shaw und anderen Labormitgliedern gelernt und sich dann durch den Graduiertenkurs Theorie und Anwendungen der Lichtmikroskopie weitergebildet.

„Wir bilden fast ausschließlich lebende Zellproben ab und erhalten eine unglaubliche Auflösung“, sagte er. „Die konfokale Mikroskopie ermöglicht es uns, 3D-Konstruktionen zu erstellen, was uns eine einzigartige Perspektive und Klarheit gibt. Sie ist auch ein leistungsstarkes Werkzeug, um uns dabei zu helfen, unsere Wissenschaft anderen mitzuteilen, da sie dieses 3D-Bild sehen können.“

Mary Cowser, eine Studentin, die bei Bedsole arbeitet, sagte, dass die Bilder der konfokalen Mikroskopie dabei helfen, die Wissenschaft zum Leben zu erwecken.

„Das Erstellen von Bildern mit lebendigen Farben durch Färben verschiedener Teile von Pilzstrukturen gibt uns ein Bild dieser Struktur, das mit Farbe verstärkt wird“, sagte sie. „Und in der Lage zu sein, Strukturen in 3D zu sehen, während sie in Echtzeit wachsen, ist faszinierend und kann viele Einblicke in ihre Funktionsweise geben. Diese Bilder helfen uns, mehr über Krankheitserreger und ihre Mechanismen zu erfahren, was den Umweltwissenschaften zugute kommt.“

Bedsole, Cowser und andere in Shaws Klassen erhalten eine spezielle Ausbildung und vielfältige Erfahrungen in Bezug auf biologisch-wissenschaftliche Techniken.

„Es gibt eine Vielzahl von Anwendungen für die konfokale Mikroskopie in der Mikrobiologie und den Umweltwissenschaften“, sagte Shaw. „Eine Ausbildung in der Verwendung dieser Technologie bietet Umweltwissenschaftlern ein zusätzliches Maß an Erfahrung und Fachwissen, und die Technologie selbst kann für sie von großem Nutzen sein, wenn sie eine Karriere anstreben, in der sie sich mit biologischen Problemen in der Umwelt befassen.“

Multidisziplinärer Einsatz der konfokalen Mikroskopie bei Texas A&M

Shaw sagte, dass die konfokale Mikroskopie neben Anwendungen in der Pflanzenpathologie, Mikrobiologie und den Bioumweltwissenschaften insgesamt auch anderen akademischen Disziplinen zugute kommt.

Shaw und sein Team haben mit anderen texanischen A&M-Forschern an der interdisziplinären und multidisziplinären Nutzung dieser Technologie zur Förderung der Wissenschaft zusammengearbeitet.

Zum Beispiel haben Matthew Sachs, Ph.D., Professor am Fachbereich Biologie des College of Arts and Sciences, und der Doktorand Matthew Breuer die konfokale Mikroskopie in ihrer Forschung zu neuartigen Methoden zur Bekämpfung von Pilzpathogenen eingesetzt.

Zu den Pilzpathogenen, die sie untersuchen, gehört Cryptococcus neoformans, der jährlich für geschätzte 181.000 Todesfälle verantwortlich ist. Gehirninfektionen durch C. neoformans, Kryptokokkenmeningitis genannt, treten hauptsächlich in Subsahara-Afrika auf.

Sachs sagte, dass die Verwendung der konfokalen Mikroskopie von wesentlicher Bedeutung war seine Forschung, um die potenzielle Wirksamkeit von Sertralin zu verstehenein häufig verschriebenes Antidepressivum, als antimykotische Behandlung.

„Die Knappheit an Behandlungen und die zunehmende Resistenz gegen aktuelle Therapeutika unterstreichen die Notwendigkeit, neuartige Antimykotika zu entwickeln oder zu identifizieren, die für den klinischen Einsatz geeignet sind“, sagte er. „Unsere bisherige Forschung hat gezeigt, dass Sertralin antimykotische Eigenschaften hat, und die Umnutzung bestehender, von der FDA zugelassener Verbindungen wie Sertralin als antimykotische Therapeutika könnte eine effiziente und effektive Strategie sein.“

Sachs und sein Team verwendeten konfokale Mikroskopie, um Bilder mit höherer Auflösung von lebenden Cryptococcus-Zellen zu erhalten und zu sehen, wie sie von Sertralin beeinflusst wurden.

„Diese Bilder, die wir in Zusammenarbeit mit Dr. Shaw erhalten haben, waren entscheidend für die Ausrichtung unserer Forschung und das Wissen, worauf wir unsere Bemühungen konzentrieren müssen, um wichtige Verbindungen zu entdecken, die uns bei der Bekämpfung von Pilzinfektionen helfen können“, sagte er.

In einer weiteren Zusammenarbeit mit Shaws Labor, ZJ Pei, Ph.D., Professor am College of Engineering Wm Michael Barnes ’64 Department of Industrial and Systems Engineering, und Hongmin Qin, Ph.D., Associate Professor am Department of Biology haben zusammen mit anderen die konfokale Mikroskopie für die Forschung im Zusammenhang mit dem Bioprinting unter Verwendung von Pflanzen- oder Algenzellen verwendet.

„Frühere Studien zu den Auswirkungen des Extrusionsdrucks und des Nadeldurchmessers auf die Zelllebensfähigkeit beim Bioprinting haben tierische Zellen verwendet, aber zuvor gab es keine Berichte darüber, wie sie die Zelllebensfähigkeit bei Verwendung von Pflanzen- oder Algenzellen beeinflussten“, sagte Pei. „Die Zellmenge ist ein wichtiger Indikator für die Lebensfähigkeit von Zellen, und unser Team verwendete konfokale Mikroskopie, um die Zellmenge von 3D-gedruckten Proben zu messen.“

Die Ergebnisse von „Bioprinting Using Algae: Effects of Extrusion Pressure and Needle Diameter on Cell Quantity in Printed Samples“ wurden in gedruckt Zeitschrift für Fertigungswissenschaft und -technik, eine Veröffentlichung der American Society of Mechanical Engineers.

„Das Wissen über die Trends der Auswirkungen des Extrusionsdrucks und des Nadeldurchmessers auf die Menge der Algenzellen wird beim Drucken mit Algen von Vorteil sein, insbesondere bei der Bestimmung des richtigen Extrusionsdrucks und des richtigen Nadeldurchmessers“, sagte Pei.

Shaw und Pei arbeiten auch an der Entwicklung der Technologie zum 3D-Druck von pilzbesiedelten Bioabfällen wie Reishülsen oder Stroh zur Verwendung als Baumaterial.

Wichtigere Forschung zum Umweltmikrobiom

Sanjay Antony-Babu, Ph.D., Assistenzprofessor in der Abteilung für Pflanzenpathologie und Mikrobiologie, nutzt die konfokale Mikroskopie, um mehr über das „Pathobiom“ zu erfahren oder wie das Mikrobiom Bodenpilze beeinflusst, die Pflanzenkrankheiten verursachen.

In enger Zusammenarbeit mit Tom Isakeit, Ph.D., einem Pflanzenpathologen des Texas A&M AgriLife Extension Service, sagte Antony-Babu, dass sie die Pathobionten des Fusarium-Pilzes untersuchen, der das Welken verschiedener Feldfrüchte, einschließlich Baumwolle, verursacht.

„Dieser Pflanzenpilz ist ein globales Problem und verursacht weltweit Schäden und Verluste bei der Baumwollernte“, sagte er. „Wir schauen uns an, welche Bakterien sich an diesen pathogenen Pilz anheften und ihm helfen könnten.“

Antony-Babu sagte, dass Bodenmikrobiome hochkomplex sind und es möglich ist, mehr als 10 Milliarden Bakterien in einem Gramm Boden zu finden.

„Kein Organismus im Boden ist allein. Erst seit kurzem sind wir in der Lage, sie eher als Gruppen als als Individuen zu untersuchen“, sagte er. „Konfokale Visualisierung ist eine wichtige Methode, mit der wir Mikrobiome untersuchen.“

Antony-Babu sagte, sein Team verwende eine Pilzködertechnik, bei der pathogene Pilze die Bakterien rekrutieren, zu denen eine natürliche Anziehungskraft besteht.

„Wir verwenden auch eine Kombination aus molekularen und bildgebenden Verfahren – DNA/RNA-Sequenzierungsmethoden, kulturbasierte Analysen und konfokale Bildgebung – um herauszufinden, welche Organismen direkt miteinander interagieren, um Pflanzenkrankheiten auszulösen“, sagte er.

Shaw arbeitete auch mit Jeanmarie Verchot, Ph.D. zusammen, einer Professorin in der Abteilung für Pflanzenpathologie und Mikrobiologie, deren Forschung sich auf Virus-Wirt-Wechselwirkungen konzentriert, wobei konfokale Mikroskopie verwendet wurde, um die Virusreplikation in Pflanzen zu dokumentieren.

„Pilze sind entscheidende Bestandteile des Umweltmikrobioms, das uns überall umgibt“, sagte Shaw.

Er stellte fest, dass Pilze eine Rolle im Nährstoffkreislauf durch den Abbau organischer Abfälle sowie bei vielen Krankheiten spielen, die Pflanzen und Tiere betreffen.

„Es besteht auch die Gefahr, dass giftige Pilzsporen die Luftqualität in unseren gebauten Umgebungen verschlechtern, sodass Pilze uns alle täglich betreffen“, sagte Shaw.

Er sagte, dass das Verständnis, wie Pilze sich in der Umwelt vermehren und wachsen, mithilfe fortschrittlicher konfokaler Mikroskopie der Schlüssel zur menschlichen Gesundheit und zum Wohlstand ist – und ein wichtiger Bestandteil der Bioumweltwissenschaften.