Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und RNA durch den Blick durch den WALD

Ein Forscherteam hat kürzlich den Nutzen des Einsatzes eines zuvor etablierten Screening-Systems zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und RNA demonstriert. Ihre Studie ist veröffentlicht in Kommunikationschemie.

Das Team wurde von Professor Hirohide Saito (Department of Life Science Frontiers, CiRA), Dr. Kaoru R. Komatsu (ehemaliger Doktorand bei CiRA), außerordentlichem Professor Kazumitsu Onizuka und Professor Fumi Nagatsugi (Institut für multidisziplinäre Forschung) geleitet für fortgeschrittene Materialien, Universität Tohoku).

Von den neuesten SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoffen zur Bekämpfung der COVID-19-Pandemie bis hin zu Risdiplam, einem von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zugelassenen RNA-Spleißmodifikator für spinale Muskelatrophie – das Wort „RNA“ hat Eingang in die allgemeine Sprache gefunden, da es beides repräsentiert neue Klassen therapeutischer Wirkstoffe und Wirkstofftargets.

Unser Verständnis darüber, wie verschiedene RNA-Sequenzen und damit verbundene Strukturen die Wechselwirkungen mit kleinen Molekülen wie Arzneimittelverbindungen oder großen Biomolekülen wie Proteinen bestimmen, ist jedoch noch unvollständig.

In einem vorherige StudieProfessor Saito und sein Forschungsteam entwickelten ein System namens „Folded RNA Element Profiling with Structure Library“ oder FOREST, um die molekularen Details der Interaktion von RNA mit bekannten RNA-bindenden Proteinen zu untersuchen.

Für diese neue Studie veranschaulichte das gemeinsame Forschungsteam in Zusammenarbeit mit Forschern der Tohoku-Universität, wie FOREST zur Analyse kleiner molekularer Wechselwirkungen mit RNA genutzt werden kann.

Das Forschungsteam validierte zunächst die Anwendbarkeit des FOREST-Ansatzes auf kleine Moleküle, indem es untersuchte, wie eine RNA-Strukturbibliothek mit bekannten kleinen molekularen RNA-Interaktoren interagiert: G-Clamp- und Thiazinorange (TO)-Derivaten.

Die Forscher isolierten an G-Clamp gebundene RNA-Strukturen aus einer Bibliothek, die mehr als 1.800 RNA-Sequenzen umfasste, die von menschlichen Prä-miRNAs und anderen repetitiven und Kontrollsequenzen abgeleitet waren. Da diese RNA-Strukturen mit einem fluoreszierenden Farbstoff und einem RNA-Barcode verknüpft sind, könnten sie durch einen DNA-Mikroarray mit zu den RNA-Barcodes komplementären Sequenzen leicht entschlüsselt und quantifiziert werden, um eine quantitative Analyse der Interaktion von RNA-Strukturen mit dem spezifischen kleinen Molekül von Interesse zu ermöglichen.

Wie erwartet identifizierten sie eine bevorzugte Bindung an Guanosin (G)-haltige einzel- und doppelsträngige RNA-Sequenzen (ssRNA bzw. dsRNA) durch G-Clamp. Aus der RNA-Strukturbibliothek wählte das Forschungsteam Sequenzen aus, die eine Bindung mit hoher, mittlerer oder niedriger Affinität an die G-Klemme zeigen, zur Validierung durch ein unabhängiges fluoreszenzbasiertes Experiment, das die scheinbaren Dissoziationskonstanten einzelner Wechselwirkungen direkt misst.

Bemerkenswerterweise beobachteten sie eine gute Korrelation zwischen der durch den FOREST-Ansatz geschätzten relativen Bindungsaffinität und den scheinbaren Dissoziationskonstanten, die durch den fluoreszenzbasierten Bindungsassay bestimmt wurden, was auf die hohe Robustheit dieser Methode zur Quantifizierung von Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und RNA hinweist.

Darüber hinaus entdeckten sie durch die Mutation einer spezifischen RNA-Schleifenstruktur mit mehreren Guanosinen an verschiedenen Stellen, dass die G-Klemme nicht mit allen Guanosinen in der Schleife gleichermaßen interagiert, sondern dass zusätzlicher struktureller Kontext die Interaktion beeinflussen kann.

Umgekehrt werden TO-Derivate häufig als Sonden für Fluoreszenzindikator-Verdrängungstests (FID) verwendet. Anschließend mischten die Forscher TO und TO-3 separat mit einer erweiterten RNA-Strukturbibliothek, die zusätzliche Sequenzen aus SARS-CoV-2- und Influenza-A-Virus-RNA enthielt, um TO-Derivate für RNA-Messungen besser charakterisieren zu können.

Während zwischen den Bindungsprofilen von RNA-Strukturen, die mit G-Klammern und TO-Derivaten interagieren, keine Korrelation bestand, hatten TO und TO-3 erwartungsgemäß ähnliche Bindungsprofile mit einigen geringfügigen Unterschieden.

Weitere Vergleiche zwischen TO-N3, TO-N3-2 und TO-3-N3 ergaben, dass die Linkerposition einen mäßigen Einfluss auf die RNA-Bindungsprofile hat. Darüber hinaus erkannten die Forscher anhand dieser Bindungsprofile einige Basen- und Schleifenpositionspräferenzen, die TO-Derivate bei der Interaktion mit RNA-Strukturen haben.

Darüber hinaus erweiterte das Forschungsteam seine Analyse von TO-Derivaten, indem es die von FOREST bestimmten relativen Bindungsaffinitäten mit den scheinbaren Dissoziationskonstanten verglich, die für kommerziell erhältliche fluoreszierende Nukleinsäureindikatoren, TO-PRO-1 und TO-PRO-3, durch den fluoreszenzbasierten Bindungstest gemessen wurden .

Durch diese Analyse stellten sie fest, dass TO-N3-2 zwar das Bindungsprofil von TO-PRO1 im Vergleich zu TO-3-N3 genauer darstellen könnte, jedoch sowohl TO-N3-2 als auch TO-3-N3 TO-PRO-3 etwa gleich gut simulieren und somit wichtige strukturelle Erkenntnisse für die Verbesserung der Paarungen von Ziel-RNA und Fluoreszenzindikatoren für FID-Tests liefern.

Anhand der für TO-Derivate ermittelten Bindungsprofile wählte das Forschungsteam Kombinationen aus Fluoreszenzindikatoren (TO-PRO-1 oder TO-PRO-3) und Prä-miRNA-Sequenzen aus, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie in Tumoren mit mittleren Bindungsaffinitäten für FID-Assays fehlreguliert sind.

Als Proof-of-Concept durchsuchten die Forscher eine kommerziell erhältliche chemische Bibliothek mit 118 Verbindungen, um kleine Moleküle zu identifizieren, die in der Lage sind, mit krankheitsassoziierten prä-miRNAs zu interagieren. Durch diese Bemühungen identifizierten sie Baicalein (Bai), Myricetin (Myr), Chelerythrinchlorid (Che) und AS 602801 (AS) als mögliche Hit-Verbindungen. Während Myr und Che bekanntermaßen DNA und RNA binden, war dies der erste Nachweis von AS als Nukleinsäure-Interaktor.

Insbesondere beobachteten die Forscher unterschiedliche Ergebnisse, wenn TO-PRO-1 oder TO-PRO-3 als Fluoreszenzindikator verwendet wurde, was darauf hindeutet, dass unterschiedliche Indikatoren verwendet werden sollten, um falsch positive und negative Identifizierungen zu vermeiden. Weitere Untersuchungen von AS bestätigten die Bindung an mehrere interessierende humane prä-miRNAs, die Forscher stellten jedoch auch fest, dass die Verbindung bei der Interaktion mit RNA starke Leuchteigenschaften aufweist.

Strukturelle Untersuchungen der Verbindung legen nahe, dass sie eine chemische Einheit enthält, die wahrscheinlich für die Leuchteigenschaften verantwortlich ist, was sie zu einer interessanten Verbindung für die Weiterentwicklung zu einem neuartigen RNA-Interaktor und einer Fluoreszenzsonde macht.

In dieser Studie veranschaulicht die gemeinsame Forschungsanstrengung einmal mehr die Anwendbarkeit der FOREST-Methode, nicht nur für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen, sondern auch für die Untersuchung der feinen Details der Interaktionen zwischen RNA und kleinen Molekülen.

Angesichts des enormen Potenzials von RNA als neuem Therapieansatz in der Medizin der nächsten Generation wird die Fähigkeit, Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und RNA im großen Maßstab systematisch zu charakterisieren, enorme Auswirkungen auf die RNA-Grundlagenforschung und die Umsetzung dieses Wissens in Therapien haben.