Extrazytoplasmatische Funktions-Sigma-Faktoren (ECFs) wurden erfolgreich zur Konstruktion vorhersagbarer künstlicher Genkreisläufe in Bakterien wie Escherichia coli eingesetzt, ihre Übertragbarkeit zwischen Arten innerhalb desselben Stammes blieb jedoch unbekannt.
Nun untersuchte eine aktuelle Studie einer Gruppe von Forschern aus Deutschland und Australien das Bakterium Sinorhizobium meliloti und identifizierte ECF-Schalter mit artübergreifender Funktionalität, konstruierte genetische Schaltkreise und stellte einen Werkzeugkasten für universelle Anwendungen in der synthetischen Biologie bereit.
Im Bereich der synthetischen Biologie ist die Schaffung künstlicher Genschaltkreise mit vorhersehbaren Ergebnissen sowohl eine Herausforderung als auch eine Notwendigkeit. Extrazytoplasmatische Funktions-Sigma-Faktoren (ECFs) haben aufgrund ihrer zentralen Rolle bei der Initiierung der Transkription in Bakterien, insbesondere unter Stressbedingungen, große Aufmerksamkeit erregt. Umfangreiche Forschung hat verschiedene Gruppen von ECFs kategorisiert und ihr Potenzial zum Aufbau mehrstufiger genetischer Schaltkreise mit verzögerter Genaktivierung aufgezeigt.
Während sich diese Schaltkreise bei gut untersuchten Bakterien wie Escherichia coli als erfolgreich erwiesen haben, ist das Ausmaß, in dem ECFs zwischen Arten innerhalb desselben Stammes übertragen werden können, weiterhin ungewiss.
Um diese Lücke zu schließen, untersuchten Professorin Anke Becker vom Zentrum für Synthetische Mikrobiologie (SYNMIKRO) und der Fakultät für Biologie der Philipps-Universität, Deutschland, und ihr Team die Übertragung von ECF-Schaltern von E. coli auf das α-Proteobakterium Sinorhizobium meliloti. Ihre Studie wurde veröffentlicht in BioDesign-Forschung.
Das Team testete 20 verschiedene ECF-Schalter in S. meliloti-Bakterien, deren Funktionalität zuvor in E. coli nachgewiesen worden war. Die Schalter wurden nach ihrer Herkunft benannt und verfügten über systematische Kennzeichnungen. Sie führten diese Schalter in zwei Arten von S. meliloti-Stämmen ein – einer war der normale Wildtyp und der andere war ein modifizierter Stamm ohne eigene ECF-Schalter.
Sie fanden heraus, dass ECF-Schalter von E. coli mit einer Erfolgsquote von über 50 % erfolgreich auf S. meliloti übertragen werden konnten. Wichtig ist, dass diese Schalter ihre Funktionalität und ihr Orthogonalitätsmuster bei beiden Wirtsarten beibehielten. Es wurde festgestellt, dass Faktoren wie Transkriptionsraten, Translation, Proteinstabilität und wirtsspezifische Eigenschaften die Funktionalität von ECF-Schaltern in S. meliloti beeinflussen.
„Wir haben uns gefreut, eine so hohe Übertragbarkeit und Funktionalität der ECF-Schalter zwischen verschiedenen Arten zu beobachten. Dies deutet darauf hin, dass Ansätze der synthetischen Biologie, die in einer Bakterienart entwickelt wurden, möglicherweise auf ein breites Spektrum von Organismen angewendet werden können, was den Anwendungsbereich der Gentechnik erweitert“, erklärt Prof .Becker.
Die Studie unterstreicht, wie wichtig es ist, bei der Entwicklung synthetischer biologischer Systeme sowohl die genetischen Elemente als auch die Wirtsumgebung zu verstehen. Durch die umfassende Untersuchung dieser Faktoren können Forscher die Vorhersagbarkeit und Zuverlässigkeit von Anwendungen der synthetischen Biologie verbessern.
Ein weiteres wichtiges Ergebnis der Studie war der breite phylogenetische Akzeptanzbereich von ECF-Schaltern, der in S. meliloti und E. coli beobachtet wurde. Im Gegensatz zu einigen Bakterienarten, die enge Akzeptanzbereiche für heterologe ECF-Schalter aufweisen, zeigten S. meliloti und E. coli eine bemerkenswerte Toleranz gegenüber Schaltern verschiedener Bakterienklassen und -arten.
Dies deutet darauf hin, dass diese Arten als universelle Wirte für Anwendungen in der synthetischen Biologie dienen könnten, was möglicherweise die Entwicklung neuartiger biotechnologischer Lösungen erleichtern könnte.
Zusätzlich zur experimentellen Validierung nutzten die Forscher rechnerische Vorhersagen, um geeignete ECF/Promotor-Paare für den Transfer zwischen Bakterienwirten vorzuwählen. Diese Vorhersagen lieferten in Kombination mit experimentellen Daten wertvolle Einblicke in die Gestaltung genetischer Schaltkreise mit minimalem Crosstalk und optimaler Leistung.
Durch die Nutzung rechnerischer Vorhersagen neben experimenteller Validierung können Forscher den Design-Build-Test-Zyklus beschleunigen und die Entwicklung komplexer genetischer Schaltkreise rationalisieren.
Die Studie führte auch eine Reihe von Einzelkopie-Plasmidvektoren für den modularen Aufbau genetischer Schaltkreise in S. meliloti ein. Diese Vektoren, die mit der DNA-Assemblierungsmethode Molecular Cloning (MoClo) kompatibel sind – einer modularen Klonierungsmethode, die in der synthetischen Biologie für den präzisen und effizienten Zusammenbau von DNA-Fragmenten zu größeren Konstrukten verwendet wird – bieten eine standardisierte Plattform für die Gentechnik dieser Bakterienart.
„Unsere MoClo-kompatiblen Plasmidvektoren bieten Forschern ein vielseitiges Toolkit für den Aufbau genetischer Schaltkreise in S. meliloti. Diese Vektoren rationalisieren den Assemblierungsprozess und erleichtern die iterative Optimierung genetischer Schaltkreise, was letztendlich das Tempo der synthetischen Biologieforschung beschleunigt“, erklärt Prof. Becker.
Insgesamt stellt die Studie einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der synthetischen Biologie dar, da sie die Übertragbarkeit genetischer Schalter zwischen Bakterienarten demonstriert und wertvolle Einblicke in das Design und die Konstruktion komplexer genetischer Schaltkreise liefert. Mit weiterer Forschung und Entwicklung haben diese Erkenntnisse das Potenzial, verschiedene Branchen zu revolutionieren und drängende Herausforderungen in der Biotechnologie und darüber hinaus anzugehen.
Mehr Informationen:
Doreen Meier et al, Eine MoClo-kompatible Toolbox von ECF-Sigma-Faktor-basierten Regulierungsschaltern für proteobakterielle Chassis, BioDesign-Forschung (2023). DOI: 10.34133/bdr.0025