Unterschiedliche Strukturdomänen in MUNC-langer nichtkodierender RNA regulieren die Genexpression

In einem Papier in Zellberichte, Anindya Dutta, MD, Ph.D., und Kollegen detailliert die erste Struktur-Funktions-Studie einer langen nicht-kodierenden RNA oder lncRNA, genannt MUNC lncRNA. Ihre Ergebnisse weisen darauf hin, wie wichtig es ist, die Struktur einer lncRNA durch eine chemische Methode – und nicht durch Computermodellierung – experimentell zu bestimmen, um Strukturdomänen zu identifizieren, die mehrere unterschiedliche Funktionen haben.

Eine lncRNA ist eine RNA, die länger als 200 Basen ist und nicht in ein funktionelles Protein übersetzt wird. Es scheint, dass Menschen viele Zehntausend dieser RNAs besitzen, die durch Wechselwirkungen mit DNA, RNA oder Proteinen eine Schlüsselrolle bei der Genregulation zu spielen scheinen. Allerdings sind nur wenige funktionell charakterisiert worden, und noch weniger haben experimentell ermittelte Informationen über ihre Struktur.

Die Forscher untersuchten MUNC-lncRNA in Maus-Myoblasten, Vorläuferzellen, die sich zu Skelettmuskelzellen differenzieren können. Es ist bekannt, dass MUNC lncRNA eine wichtige Rolle bei der Bildung von Skelettmuskelgewebe durch Differenzierung spielt, einem Prozess, der als Myogenese bezeichnet wird. Die MUNC-lncRNA hat zwei Isoformen, eine mit 1.083 Nukleotiden, die zwei Exons und ein Intron hat, und eine mit 518 Nukleotiden, bei der das Intron ausgeschnitten und die beiden Exons zusammengespleißt wurden.

Das Wissen darüber, wie lncRNAs bei der Differenzierung funktionieren, ist potenziell wichtig für das Verständnis und die Bekämpfung von Krebs, sagt Dutta, da Krebszellen dedifferenzierte Zellen sind. Zu verstehen, wie sie dorthin gelangen, und zu lernen, wie man das umkehrt, könnte zu neuen Therapieansätzen führen. Dutta wurde im März 2021 Vorsitzender der University of Alabama am Birmingham Department of Genetics und kam von der University of Virginia School of Medicine.

In der aktuellen Studie von MUNC lncRNA fanden die Forscher zwei wichtige Ergebnisse, als sie chemische Strukturbestimmungen der beiden Isoformen durchführten. Erstens hatten diese Strukturen mehrere strukturelle Domänen, die durch Computervorhersagen nicht erkannt wurden. Dies zeigt die Notwendigkeit, Strukturen experimentell zu bestimmen. Zweitens waren diese Domänen zwischen den beiden Isoformen weitgehend konserviert, was auf die Stabilität der Domänen hinweist. Die Domänen umfassten sechs übliche „Haarnadeln“, bei denen sich die RNA in sich selbst zurückfaltet, um einen Doppelstrang zu bilden, der in jeder Isoform vorkommt. Die gespleißte Isoform hatte eine zusätzliche Haarnadel und eine Schleife, die in der ungespleißten Isoform nicht zu sehen waren.

Auch als die Forscher die gespleißte Isoform, die noch in der Zelle chemisch behandelt wurde, mit der gespleißten Isoform verglichen, die nach der Reinigung chemisch behandelt wurde, sahen sie einen Unterschied. Die innerhalb der Zelle behandelte lncRNA von MUNC hatte zwei geschützte Regionen, die der außerhalb der Zelle behandelten lncRNA fehlten. Dies könnte bedeuten, dass diese Regionen mit Proteinen innerhalb der Zelle interagierten und verhinderten, dass das chemische Reagenz die RNA-Basen erreichte, die die Proteine ​​​​berührten.

Als nächstes machten sich Dutta und Kollegen daran, die funktionelle Bedeutung dieser Domänen zu untersuchen.

Beide Isoformen waren, wenn sie in Maus-Myoblastenzellen überexprimiert wurden, promyogen, was bedeutet, dass sie die Expression von Genen förderten, die an der Differenzierung von Muskelzellen beteiligt sind, wahrscheinlich durch die Aktivierung eines gemeinsamen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Während jedoch 645 Gene durch beide Formen von MUNC hochreguliert wurden, wurden 2.730 andere Gene nur durch die eine oder andere Isoform hochreguliert. Somit kontrollieren sie unterschiedliche Gensätze.

Die Forscher stellten Varianten der gespleißten Isoform her, denen entweder eine bestimmte strukturelle Domäne fehlte oder die eine definierte Mutation in einer einzelnen Domäne aufwiesen. Jede Variante wurde in Maus-Myoblastenzellen überexprimiert, um zu sehen, wie die Unterbrechung einzelner struktureller Domänen die Expression von promyogenen Faktoren beeinflusst. Die daraus resultierenden Veränderungen in der Genexpression zeigten, dass verschiedene RNA-Domänen von MUNC für die Bindung an und die Regulierung verschiedener Gene wichtig waren. Somit könnten sie unabhängig agieren, was darauf hindeutet, dass das gespleißte MUNC so etwas wie ein Schweizer Taschenmesser ist, das verschiedene Werkzeuge in einem Taschenmesser enthält.

Die Unabhängigkeit von zwei dieser Domänen und die allgemeine Stabilität von MUNC wurde auf andere Weise gezeigt. Die chemische Strukturanalyse wurde für zwei der Varianten wiederholt – eine mit einer gemeinsamen Haarnadel-1-Deletion und die andere mit einer gemeinsamen Haarnadel-4-Deletion. Diese beiden Haarnadeln wurden untersucht, da beide für promyogene Phänotypen entscheidend sind. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Deletionen chirurgisch waren, was bedeutet, dass der Rest der Sekundärstruktur der verbleibenden RNA unverändert war.

Die Forscher testeten auch, wie der Verlust oder die Mutation der Domänen die Bindung von MUNC an zwei verschiedene Promotorstellen auf dem Chromosom für das Gen Myod1 beeinflusst, das für ein Protein kodiert, das als Hauptschalter für die Myogenese fungiert. Eine solche Bindung an beiden Stellen führt zu einer verstärkten Expression des Myod1-Gens. Experimente zeigten, dass drei der Haarnadeln für die Bindung an beiden Stellen erforderlich waren. Zusätzlich waren sechs weitere Domänen wichtig für die Bindung, aber mit einem Unterschied – drei beeinflussten die Bindung an einer Stelle und die anderen drei beeinflussten die Bindung an der anderen Stelle. Somit vermitteln unterschiedliche Domänen unterschiedliche Merkmale der promyogenen Aktivität von MUNC.

Um diese komplexe Geschichte zu ergänzen, testeten Dutta und Kollegen, ob die Struktur oder die Sequenz der RNA-Basen für die funktionelle Rolle von Common-Hairpin-1 und Common-Hairpin-4 bei der promyogenen Genexpression verantwortlich ist. Sie taten dies, indem sie Mutanten der beiden Haarnadeln herstellten, bei denen verschiedene Abschnitte der RNA-Basensequenz verändert wurden, ohne die Haarnadelstruktur zu verändern. Das Ergebnis? Die Mutanten behielten ihre Funktion, Myod1 zu induzieren, was darauf hinweist, dass die Form, nicht die RNA-Sequenz, entscheidend war. „Basierend auf den Ergebnissen von acht unabhängigen Sequenzmutanten schließen wir, dass die MUNC-Funktion, die Common-Hairpin-1 und Common-Hairpin-4 zugeschrieben wird, hauptsächlich von der Struktur bestimmt wird“, sagte Dutta.

„Insgesamt“, sagte Dutta, „beteiligen sich die multimodalen Mechanismen der Regulation der Genexpression durch MUNC an verschiedenen Domänen von MUNC und wahrscheinlich an verschiedenen Proteinpartnern. MUNC rekrutiert je nach genomischem Kontext unterschiedliche kooperative Mechanismen, und dieses Verhalten ist wahrscheinlich beispielhaft dafür andere lncRNAs, die die Genexpression regulieren.“