Tool der synthetischen Biologie deckt Genregulationsnetzwerke in E. coli umfassend auf

Das komplizierte Zusammenspiel der Genexpression in lebenden Zellen ähnelt einer gut orchestrierten Symphonie, bei der jedes Gen in perfekter Harmonie seine Rolle spielt, um sicherzustellen, dass die Zellen ordnungsgemäß funktionieren. Das Herzstück dieser Symphonie sind Transkriptionsfaktoren (TFs), molekulare Maestros, die die Expression von Genen regulieren, indem sie an spezifische DNA-Sequenzen, sogenannte Promotoren, binden.

Um die Geheimnisse dieser regulatorischen Netzwerke im Genommaßstab zu entschlüsseln, ist eine umfassende Sammlung von Genexpressionsprofilen erforderlich. Die Messung der Genexpressionsreaktionen für jedes TF- und Promotorpaar stellte jedoch aufgrund der schieren Anzahl möglicher Kombinationen eine gewaltige Herausforderung dar, selbst in relativ einfachen Organismen wie z als Bakterien.

Um dieser Herausforderung zu begegnen, entwickelten Forscher unter der Leitung von Fuzhong Zhang, Professor für Energie-, Umwelt- und Chemieingenieurwesen an der McKelvey School of Engineering der Washington University in St. Louis, eine Technik namens „Pooled Promoter Responses to TF Perturbation Sequencing“ (PPTP-seq).

PPTP-seq integriert die CRISPR-Genbearbeitung mit einer kombinatorischen Bibliothek, die alle bekannten TF im Zielgenom und entsprechende Promotoren enthält. Die bahnbrechende Technik ermöglicht es Wissenschaftlern, die Genregulation durch Hunderte von TFs, die auf Tausende von Promotoren wirken, in einem einzigen Experiment zu untersuchen, das etwa zwei Wochen dauert und leicht verarbeitbare Daten liefert.

In einer Studie veröffentlicht online am 16. September NaturkommunikationErstautor Yichao Han, der 2023 während seiner Arbeit in Zhangs Labor seinen Doktortitel in Umwelttechnik erlangte, nutzte PPTP-seq, um systematisch die Aktivität von 1.372 E. coli-Promotoren zu untersuchen, wenn sie einer Störung jedes der 183 TFs ausgesetzt waren.

Dieses einzelne Experiment lieferte Einblicke in mehr als 200.000 potenzielle TF-Promotor-Wechselwirkungen, zeichnete ein umfassendes Bild der regulatorischen Landschaft von E. coli, enthüllte neue regulatorische Reaktionen und bereitete den Weg für zukünftige genetische Erforschung.

„Als Werkzeug der synthetischen Biologie ermöglicht PPTP-seq Hochdurchsatzuntersuchungen der Genregulation“, sagte Zhang. „Das am häufigsten verwendete Tool zur Untersuchung der Genregulation, RNA-seq, kann rund 4.000 Regulator-Gen-Antworten aufdecken. PPTP-seq erhöhte diese Zahl um das 50-fache und deckte 200.000 Regulator-Gen-Antworten aus einem einzigen Experiment auf. Mit dieser leistungsstarken neuen Funktion Mit diesem Tool konnten wir ein umfassendes regulatorisches Netzwerk für E. coli auf Genomebene bereitstellen.“

PPTP-seq liefert nicht nur viel mehr Daten, sondern kann auch die komplexen Nuancen der Genregulation in verschiedenen zellulären Kontexten erfassen. Indem sie E. coli unterschiedlichen Wachstumsmedien aussetzten, deckten die Forscher komplexe Promotoraktivitäten und Genregulation auf und gaben einen Einblick in die Anpassungsfähigkeit dieser Mikroorganismen.

„Sogar einfache Bakterien haben mehr als 4.000 Gene“, sagte Han, der jetzt Forscher am Pacific Northwest National Laboratory ist. „TFs steuern die Genexpressionsniveaus, indem sie Gene als Reaktion auf Umweltreize ein- und ausschalten. Diese Kontrollen erfolgen jedoch nicht immer direkt. Die nachgelagerten Auswirkungen der Aktivierung eines TF könnten mehrere TFs und Gene betreffen.“

Han stellte fest, dass die Genregulation kein einheitliches Phänomen ist, sondern vielmehr ein fein abgestimmter Prozess, der von Umwelteinflüssen abhängt. Da das Genregulationsnetzwerk komplex ist, erwiesen sich frühere Tools zu seiner Untersuchung hinsichtlich des Zeit- und Arbeitsaufwands als mühsam. Mit seiner Fähigkeit, einzelne TFs mithilfe von CRISPR präzise zu stören und Downstream-Effekte für alle TF- und Promotorkombinationen aufzuzeichnen, zeigt PPTP-seq, wie verschiedene Promotoren unter unterschiedlichen Bedingungen reagieren, und unterstreicht so die dynamische Natur der Genexpression, selbst in einfachen Organismen.

„Letztendlich können wir mit PPTP-seq systembiologische Studien mit viel größerer Effizienz durchführen – 50-mal effizienter als aktuelle Ansätze“, sagte Zhang. „Unsere Arbeit hat ein umfassendes regulatorisches Reaktionsnetzwerk in Bakterien offenbart, mit vielen bisher unbekannten Reaktionen.“

Dieses tiefere Verständnis der zellulären Regulation könnte weitreichende Auswirkungen auf Bereiche wie Biotechnologie und Medizin haben. Han wies insbesondere auf mögliche Anwendungen in der Bioproduktion hin, wo neu entdeckte nachgelagerte Reaktionen genutzt werden könnten, um Bakterien so zu programmieren, dass sie gewünschte Materialien produzieren, selbst unter nicht idealen Bedingungen. Über Bakterien hinaus könnte PPTP-seq schließlich auch zur Untersuchung komplexerer Zellen, einschließlich tierischer Zellen, eingesetzt werden.

„Ein großer Vorteil der PPTP-seq-Technologie besteht darin, dass wir das gesamte Genregulationsnetzwerk auf einmal untersuchen und alle Wechselwirkungen unter verschiedenen Bedingungen einheitlich prüfen, sodass wir direkte Vergleiche anstellen können“, sagte Han. „Im Moment ist das Grundlagenforschung. Wir betrachten E. coli als Modellorganismus, weil er bereits gut erforscht ist, aber wir haben immer noch neue Dinge darüber entdeckt. Das deutet darauf hin, dass es noch mehr zu lernen gibt, wenn wir uns darauf konzentrieren.“ andere Zellen und Anwendungen.