Plasmide haben eine umfangreiche Verwendung in der Grundlagen- und angewandten Biologie. Diese kleinen, kreisförmigen DNA-Moleküle werden von Wissenschaftlern verwendet, um neue Gene in einen Zielorganismus einzuführen. Plasmide sind bekannt für ihre Anwendungen in der Produktion von therapeutischen Proteinen wie Insulin und werden in großem Umfang in der großtechnischen Produktion vieler Bioprodukte verwendet.
Das Entwerfen und Konstruieren von Plasmiden bleibt jedoch einer der zeitaufwändigsten und arbeitsintensivsten Schritte in der biologischen Forschung.
Um dies anzugehen, haben Behnam Enghiad, Pu Xue und andere Forscher der University of Illinois Urbana-Champaign am Center for Advanced Bioenergy and Bioproducts Innovation (CABBI) eine vielseitige und automatisierte Plattform für Plasmiddesign und -konstruktion namens PlasmidMaker entwickelt. Ihre Arbeit wurde kürzlich in veröffentlicht Naturkommunikation.
Die Erstellung eines Plasmids beginnt mit dem Design. Um diesen Designprozess zu unterstützen, verfügt PlasmidMaker über eine benutzerfreundliche Webschnittstelle, mit der Forscher intuitiv das perfekte Plasmid für ihre Bedürfnisse visualisieren und zusammenstellen können.
Sobald das Plasmid entworfen wurde, wird es dem PlasmidMaker-Team vorgelegt, und eine Bestellung für das Plasmid wird bei der Illinois Biological Foundry for Advanced Biomanufacturing (iBioFAB) aufgegeben, wo das Plasmid gebaut wird. iBioFAB, das sich am Carl R. Woese Institute for Genomic Biology (IGB) auf dem Campus der U of I befindet, ist eine vollständig integrierte rechnerische und physische Infrastruktur, die die schnelle Herstellung, Qualitätskontrolle und Analyse genetischer Konstrukte unterstützt. Es verfügt über einen zentralen Roboterarm, der Laborgeräte zwischen Instrumenten transportiert, die unterschiedliche Vorgänge wie Pipettieren, Inkubieren oder Thermocycling ausführen.
Der Plasmid-Erstellungsprozess ist automatisiert: Proben werden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Reinigung vorbereitet, die DNA-Sequenz wird zusammengesetzt und transformiert, und die Plasmide werden bestätigt und eingefroren, alles mit geringer menschlicher Beteiligung.
Neben der Automatisierung und Präzision, die iBioFAB bietet, leistet die PlasmidMaker-Plattform auch Pionierarbeit bei einer neuen hochflexiblen Methode zum Zusammenfügen mehrerer DNA-Fragmente zu einem Plasmid unter Verwendung von auf Pyrococcus furiosus Argonaute (PfAgo) basierenden künstlichen Restriktionsenzymen (AREs).
Restriktionsenzyme werden seit langem bei der Plasmidkonstruktion verwendet, da sie DNA-Moleküle an bestimmten Basensequenzen, den sogenannten Erkennungssequenzen, spalten können. Diese Erkennungssequenzen sind jedoch normalerweise kurz, was es schwierig macht, mit ihnen zu arbeiten. Eine kurze Sequenz kommt wahrscheinlich mehrmals in einem DNA-Molekül vor, in diesem Fall würde das Restriktionsenzym zu viele Schnitte machen.
„Bei früheren DNA-Assemblierungsmethoden war es oft schwierig, die richtigen Restriktionsenzyme zu finden, die das Plasmid schneiden und die DNA-Fragmente ersetzen können“, sagte Huimin Zhao, Co-Autor und Inhaber des Steven L. Miller-Lehrstuhls für chemische und biomolekulare Technik ( ChBE) in Illinois. „Die auf PfAgo basierenden AREs bieten eine größere Flexibilität und Präzision, da sie so programmiert werden können, dass sie an praktisch jeder Stelle nach längeren Erkennungssequenzen suchen.“
Mit all den Verbesserungen, die es auf den Tisch bringt, hoffen die Teammitglieder von CABBI, einem von vier vom US-Energieministerium finanzierten Bioenergie-Forschungszentren in den Vereinigten Staaten, dass PlasmidMaker die Entwicklung der synthetischen Biologie für biotechnologische Anwendungen beschleunigen wird.
„Dieses Tool wird CABBI-Forschern zur Verfügung stehen, und wir wollen es schließlich allen Forschern in den anderen drei Bioenergie-Forschungszentren zur Verfügung stellen“, sagte Zhao. „Wenn es gut läuft, hoffen wir, es allen Forschern überall zur Verfügung stellen zu können.“
Behnam Enghiad et al., PlasmidMaker ist eine vielseitige, automatisierte End-to-End-Plattform mit hohem Durchsatz für die Plasmidkonstruktion. Naturkommunikation (2022). DOI: 10.1038/s41467-022-30355-y