Schnelles Stamm-Engineering für eine schnelle Bioproduktion

Der Einsatz gentechnisch veränderter Mikroben als mikroskopisch kleine Fabriken hat der Welt zuverlässige Quellen für lebensrettende Medikamente verschafft, die Lebensmittelindustrie revolutioniert und es uns ermöglicht, nachhaltige Versionen wertvoller Chemikalien herzustellen, die zuvor aus Erdöl hergestellt wurden.

Doch hinter jedem biotechnologisch hergestellten Produkt, das heute auf dem Markt ist, steckt die Investition jahrelanger Arbeit und vieler Millionen Dollar an Forschungs- und Entwicklungsgeldern. Wissenschaftler des Berkeley Lab möchten der aufstrebenden Industrie dabei helfen, neue Höhen zu erreichen, indem sie den Prozess der Mikrobenentwicklung beschleunigen und rationalisieren, um wichtige Verbindungen mit kommerziell nutzbarer Effizienz herzustellen.

Ein Team unter der Leitung der leitenden Wissenschaftlerin Aindrila Mukhopadhyay hat einen Arbeitsablauf entwickelt, der die CRISPR-Genbearbeitung mit einer Reihe von Computermodellen der mikrobiellen Genexpression und Enzymaktivität kombiniert, die zur Vorhersage der erforderlichen Genbearbeitungen verwendet werden können. Ihr neuestes Werk wurde kürzlich veröffentlicht in Zellberichte.

„Ein Großteil des Stammdesigns basiert immer noch auf Versuch und Irrtum, was mühsam und zeitaufwändig ist. Wir haben gezeigt, dass man die Produktentwicklung enorm reduzieren kann, indem man gezielte Ansätze, die sich auf bestimmte Gene und Proteine ​​konzentrieren, mit Methoden kombiniert, die das gesamte Genom modellieren.“ Zyklen von Jahren auf Monate“, sagte Co-Erstautor Thomas Eng, stellvertretender Direktor für Host Engineering am Joint BioEnergy Institute (JBEI), einem Bioenergie-Forschungszentrum des Department of Energy unter der Leitung der Biosciences Area des Berkeley Lab.

Der Workflow namens Product Substrate Pairing (PSP) hat sich bereits als vielversprechend für die Entwicklung von Stämmen erwiesen, die gängige bakterielle Nahrungsquellen in Zielmoleküle umwandeln können. Um jedoch die wahre Leistungsfähigkeit des Ansatzes zu demonstrieren, konzentrierten sich ihre neuen Arbeiten auf die Entwicklung eines Stamms, der sich von Molekülen ernähren kann, die aus Lignin stammen – einer Art zähem, faserigem Pflanzengewebe.

Lignin ist ein idealer umweltfreundlicher Vorläufer für die Ernährung von Mikroben in der Bioproduktion, da es in den Hunderten Millionen Tonnen Pflanzenabfällen, die jedes Jahr bei Nachernte- und Landschaftsrodungen anfallen, reichlich vorhanden ist. Derzeit basieren die meisten Bioproduktionsprozesse auf einfachen Zuckermolekülen, die aus speziell angebauten Pflanzen, sogenannten Rohstoffen, gewonnen werden. Durch das Upcycling des reichlich vorhandenen Lignins hoffen die JBEI-Wissenschaftler jedoch, die biobasierte Produktion erneuerbarer und CO2-neutraler zu machen.

Das Team begann mit einem Bakterienstamm, der sich auf natürliche Weise von einem Ligninderivat ernähren kann, und untersuchte dann mithilfe von PSP, welche nativen Gene gelöscht werden mussten, welche nicht-nativen Gene eingefügt werden mussten und welche Kultivierungsbedingungen dafür erforderlich waren Bakterien dazu, große Mengen einer nicht-nativen Verbindung zu produzieren.

Tausende von Computerentwürfen wurden evaluiert und schließlich zwei im Labor getestet. In diesem Fall veränderten sie die Bakterien, um Indigoidin zu produzieren, einen blauen Farbstoff mit vielen eigenen Verwendungsmöglichkeiten, der auch als guter Ersatz für andere wünschenswerte Moleküle dient. Durch iterative Runden der Computermodellierung und realen Kultivierung und Analyse von CRISPR-modifizierten Stämmen demonstrierten die Autoren einen verallgemeinerbaren Arbeitsablauf, der die Krücke des Stammdesigns durch Versuch und Irrtum beseitigt.

„Die besondere Würze ergibt sich aus der Art und Weise, wie gut etablierte Werkzeuge miteinander integriert werden, um einen Arbeitsablauf zu schaffen, der auf jede Mikrobe und jeden Bioprozess anwendbar ist“, sagte Co-Erstautorin Deepanwita Banerjee, Wissenschaftlerin für Computerforschung in der Host Engineering Group des JBEI. „Unsere paradigmenwechselnde Arbeit zeigt eine logische und effiziente Methode zum Aufbau und Testen von Stämmen, die auf dem Verhalten der Zellen in jedem Schritt des Entwicklungszyklus basiert. Dies ist ein großer Schritt in Richtung eines prädiktiven Verständnisses der Zellfunktion.“

Das Team nutzte auch das Fachwissen und die Instrumentierung von Berkeley Lab, um seine mikrobiellen Fabriken anhand vieler verschiedener Rubriken vollständig zu charakterisieren. Christopher J. Petzold und die Functional Genomics Group des JBEI nutzten Hochdurchsatzmethoden, um schnell zu charakterisieren, wie die Stämme ihre Proteinexpression für diesen neuen Zweck veränderten.

Carolyn Larabell, eine leitende Wissenschaftlerin im Bereich Biowissenschaften, und ihr Team führten an der Advanced Light Source eine weiche Röntgentomographie durch, um ultrahochauflösende Bilder zu liefern, die dabei helfen, zu identifizieren, welche Zellen am besten für die Bioproduktion geeignet sind. Schließlich stellten Blake Simmons und Wissenschaftler der JBEI Deconstruction Division Anleitungen und Proben von ligninreichem Sorghum zur Verfügung, um zu demonstrieren, wie dieser Bioproduktionsprozess unter realen Bedingungen funktionieren würde.

Nach etwa einem Jahr Arbeit war das Team in der Lage, eine Sorte mit einem extrem hohen Ertrag von 77 % zu entwickeln.

„Das gesamte Unternehmen der nachhaltigen Bioproduktion hängt von unserer Fähigkeit ab, ein breites Spektrum an Ausgangsmaterialien zu verwenden“, sagte Mukhopadhyay, Vizepräsident für Biokraftstoffe und Bioprodukte und Direktor für Host Engineering bei JBEI. „Einzelne Methoden können jedoch durch unser unvollständiges Wissen über weniger verstandene Vorläufer eingeschränkt sein. Unser Ensemble-Workflow nutzt gut entwickelte Werkzeuge und sollte auf viele Kohlenstoffquellen, mikrobielle Systeme und Bioproduktionsziele anwendbar sein.“