Fortschritte in der Molekularbiologie haben gezeigt, dass pep-tRNAs – naszierende Polypeptide innerhalb des Ribosoms, die kovalent an Transfer-RNA gebunden sind – an unzähligen Zellfunktionen, einschließlich der Genexpression, beteiligt sind. Alle Proteine existieren irgendwann als pep-tRNAs, und die Untersuchung dieser Translationszwischenprodukte ist von entscheidender Bedeutung, da sie Eigenschaften sowohl von RNA als auch von Proteinen besitzen und Forschern helfen können, die Besonderheiten der Translation besser zu verstehen.
Abhängig von Stimuli und/oder Belastungen ist die Translationsregulation sehr schnell und umfasst Initiation, Elongation und Elongationspause. Um tiefere Einblicke in den Prozess der Translation zu gewinnen, bedarf es daher einer geeigneten Methode, um pep-tRNAs in großen Mengen zu verarbeiten. Diese Nuancen haben die Entwicklung molekularer Werkzeuge zur Untersuchung der zellulären Translation vorangetrieben.
Gegenwärtig nutzen die beiden primären Ansätze, die zur Untersuchung der zellulären Übersetzung verwendet werden, sehr unterschiedliche Strategien. Die erste, das Ribosomen-Profiling, eine leistungsstarke Deep-Sequencing-Technologie, überwacht die Translation, indem sie auf Ribosomen-geschützte mRNA-Fragmente abzielt, die durch RNase-Verdau produziert werden. Leider ist dieser Ansatz von Natur aus nicht in der Lage, pep-tRNAs zu erfassen, und ist zeitaufwändig, teuer und datenintensiv.
Die Alternative beruht auf Proteomik mit Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektroskopie (LC-MS/MS) und erfordert die Verwendung ungewöhnlicher Aminosäuren zur Markierung von Polypeptiden. Solche Proteomik-Ansätze sind jedoch zeitintensiv und erfassen vor allem nicht den Translationselongationsstatus der Zelle, da pep-tRNAs nicht direkt angegriffen werden.
Um diese Einschränkungen der „pep-tRNA-ome“-Technologie zu umgehen, hat ein Team von Wissenschaftlern des Tokyo Institute of Technology (Tokyo Tech) unter der Leitung von Prof. Hideki Taguchi PETEOS entwickelt. Ihre Ergebnisse wurden nun in veröffentlicht Nukleinsäureforschung.
In Bezug auf die Hauptvorteile ihrer Arbeit erklärt Prof. Taguchi: „Diese nicht-markierende Methode ist insofern einzigartig, als sie pep-tRNAs spezifisch anreichert und schnell einfängt und gleichzeitig herkömmliche Translatom-Analyseplattformen ergänzt.“
PETEOS hat vier Schritte. Zunächst wird die RNA mit organischer Lösungsmittelextraktion angereichert und dann auf einer Kieselgelsäule isoliert. Als nächstes werden die Zielpolypeptide in den isolierten pep-tRNAs von ihren Ribonukleotiden getrennt, indem eine Kombination aus hohem pH-Wert und Temperatur verwendet wird. Dann werden die freigesetzten Polypeptide einem enzymatischen Verdau unterzogen und gespalten. Und schließlich werden diese Polypeptide unter Verwendung von Shotgun-LC-MS/MS-Proteomik identifiziert.
„Als Proof-of-Concept konnten wir mit PETEOS fast 800 E. coli-Proteine identifizieren, die von pep-tRNA abgeleitet wurden. Wichtig ist, dass diese Proteine N-Termini-angereichert waren, was unterstreicht, dass die Methode wirklich die erfasst intermediären pep-tRNA-Pool während der Translation“, sagt Prof. Taguchi über die Bedeutung ihrer neuen Methode.
Das Team konnte auch zeigen, dass PETEOS „Screenshots“ des Nascentomes – des Pools entstehender Pep-tRNAs, die zu einem bestimmten Zeitpunkt vorhanden sind – aufnehmen konnte, wenn E. coli-Zellen Hitzeschocks und Antibiotikabehandlungen ausgesetzt wurden. PETEOS übertraf herkömmliche Methoden in Bezug auf die Fähigkeit, die akute Proteinexpression unter Hitzestress und die Neuanordnung des Nascentoms nach der Exposition gegenüber verschiedenen Antibiotika zu erfassen.
PETEOS weist einige Einschränkungen auf, darunter Schwierigkeiten bei der Analyse von pep-tRNAs in geringer Menge mit LC-MS/MS, begrenzte quantitative Kapazität aufgrund des sauren Phenol/Chloroform-Schritts, keine Auflösung auf Codonebene und Schwierigkeiten beim Erfassen des C-terminalen Endes des wachsenden Polypeptids. Einige dieser Probleme bestehen jedoch auch bei herkömmlichen Ansätzen und können überwunden werden, indem die Effizienz der C-terminalen Peptidanreicherung dieses Verfahrens verbessert wird.
Das Team glaubt, dass es ein enormes Potenzial gibt, sein Protokoll in Zukunft zu optimieren. Prof. Taguchi fasst zusammen: „Trotz der Einschränkungen sind wir zuversichtlich, dass PETEOS Potenzial hat, da es Analysen ermöglicht, die mit aktuellen Translatommethoden einfach nicht möglich sind. Am wichtigsten ist, dass es auf jeden Organismus angewendet werden kann.“ Mit mehr Forschung auf diesem Gebiet werden wir unser Verständnis der Proteinsynthese vertiefen.
Mehr Informationen:
Ayako Yamakawa et al, Eine Methode zur Anreicherung von Polypeptidyl-tRNAs, um Momentaufnahmen der Translation in der Zelle zu erfassen, Nukleinsäureforschung (2023). DOI: 10.1093/nar/gkac1276