Schaffung der Grundlage für das intrazelluläre Computing von Säugetieren mit mRNA-Schaltern

Professor Hirohide Saito und sein Forschungsteam haben einen neuen Ansatz zur Steuerung der mRNA-Translation mithilfe von Cas-Proteinen entwickelt, wodurch die Vielfalt der mRNA-Schalter erweitert und der Aufbau synthetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen erleichtert wird. Die Ergebnisse dieser Forschung wurden in veröffentlicht Naturkommunikation am 19. April 2023.

Cellular-Computing-Technologien, die eine präzise, ​​computerähnliche Steuerung von Zellfunktion und -schicksal ermöglichen, werden auf dem Gebiet der synthetischen Biologie erforscht. Durch die Programmierung von Genexpressionsmustern nach Wunsch können Forscher unser Verständnis verschiedener biologischer Prozesse erheblich vertiefen und neue medizinische Behandlungen entwickeln. In Zukunft könnte diese Technologie dazu beitragen, die therapeutische Wirksamkeit zu verbessern und Nebenwirkungen bei der Arzneimittelforschung, Impfstoffentwicklung, Zelltransplantation und anderen Formen der medizinischen Behandlung zu reduzieren.

Um solch präzise Steuerungssysteme zu schaffen, müssen komplexe Schaltkreise konstruiert werden, die Informationen wie ein Computer in lebenden Zellen verarbeiten, was wiederum den Einsatz künstlicher genetischer Schaltkreise erfordert, die auf den Bausteinen lebender Systeme wie DNA, RNA, und Proteine. Die Verfügbarkeit von Komponenten, die von Wissenschaftlern kontrolliert werden können, war jedoch ein limitierender Faktor für die präzise Programmierung des Zellverhaltens.

Kürzlich haben Forscher damit begonnen, die Kraft von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) als Translationsregulatoren zu erschließen. Dieser Ansatz wurde jedoch durch eine begrenzte Anzahl von RBPs, die in der Lage sind, die Translation zu regulieren, insbesondere solche mit Multiplex-Kompatibilität, daran gehindert, vollständig zum Aufbau posttranskriptioneller synthetischer biologischer Schaltkreise für die Grundlagenforschung und klinische Anwendungen abzuheben.

Um die Liste der als Translationsregulatoren verfügbaren RBPs zu erweitern, nutzten Saito und seine Gruppe die Fähigkeit von CRISPR-Cas-Proteinen, spezifische sgRNA-Sequenzen (Single Guide RNA) zu erkennen, indem sie sie in die 5′-UTR (untranslatierte Region) einer Ziel-mRNA einfügten das für ein Reportergenprodukt (Schalter) kodiert.

In Abwesenheit des entsprechenden Cas-Proteins (Trigger) wird das Reportergenprodukt ungehindert translatiert, was bedeutet, dass der Schalter in seinem EIN-Zustand ist. Wenn Zellen das Cas-Protein jedoch exprimieren, bindet es über die sgRNA-Sequenz an die Ziel-mRNA und blockiert die Translation des Reportergenprodukts, wodurch der Schalter in seinen AUS-Zustand gebracht wird (AUS-Schalter: EIN-Zustand → AUS-Zustand). Durch den Einbau eines sogenannten „Switch-Inverter“-Moduls in das System kann das Team diese AUS-Schalter in EIN-Schalter umwandeln (AUS-Zustand → EIN-Zustand).

Das Forschungsteam nannte dieses translationale Regulationssystem CARTRIDGE (Cas-Responsive Translational Regulation Integratable into Diverse Gene Control), da es erfolgreich biotechnologische Technologien zur Kontrolle von Cas-Proteinen wie das Split-Cas-System und Anti-CRISPR-Proteine ​​einsetzte, um die Translation von zu manipulieren viele verschiedene mRNA-Schalter.

Darüber hinaus testete das Team 25 Arten von Cas-Proteinen und stellte fest, dass 20 Proteine ​​die Translation unterdrücken können und 13 Proteine ​​nur mit ihren spezifischen mRNA-Gegenstücken interagierten, was entscheidend ist, wenn sie in Kombination zum Aufbau künstlicher genetischer Schaltkreise verwendet werden. Daher hat diese Methode die Vielfalt der verfügbaren mRNA-Schalter enorm erhöht.

Mit diesem umfangreichen Toolkit bauten die Wissenschaftler verschiedene komplexe künstliche Schaltungen, wie zum Beispiel translationale Logik-UND-Gatter und mehrschichtige Kaskaden. Sie entwarfen auch eine komplexe Halbsubtrahierer-Arithmetikschaltung in Säugetierzellen, indem sie sowohl die Transkriptions- als auch die Translationskontrolle durch Cas-Proteine ​​einsetzten.

Durch die enorme Erweiterung des molekularen Werkzeugkastens, der für die translationale Regulation zur Verfügung steht, hofft das Forschungsteam, dass diese Arbeit nicht nur RNA- und RBP-basierte Anwendungen der synthetischen Biologie inspirieren, sondern auch die zukünftige Entwicklung von Genom-Editing-Technologien und CRISPR-Studien vorantreiben wird, auf denen CARTRIDGE aufbaut.