Die durch das SARS-CoV-2-Virus verursachte COVID-19-Pandemie bedroht weiterhin die Bevölkerung auf der ganzen Welt, nachdem über 1 Million Amerikaner getötet wurden. In den letzten Wochen hat XBB.1.5, die bisher am besten übertragbare Variante, begonnen, sich über das Land auszubreiten.
Ein Aspekt des neuartigen Coronavirus, der es so ansteckend und schwer zu kontrollieren macht, ist seine Fähigkeit, die angeborene Immunabwehr des Körpers zu überlisten.
Eine neue Studie untersucht NendoU (ausgesprochen nenn-doh-YOU), ein virales Protein, das für die Taktik des Virus zur Immunumgehung verantwortlich ist. Die Struktur dieses entscheidenden Proteins wird mithilfe einer Technik, die als serielle Femtosekunden-Röntgenkristallographie bekannt ist, im Detail untersucht. Die neue Forschung erscheint in der aktuellen Ausgabe der Zeitschrift Struktur.
Zum ersten Mal wird das NendoU-Protein mit einer hohen Auflösung von 2,5 Angström bei Raumtemperatur abgebildet. Die resultierende Struktur enthüllt die zugrunde liegenden Details der Flexibilität, Dynamik und anderer Merkmale des Proteins mit beispielloser Klarheit. Solche Strukturinformationen sind entscheidend für die Entwicklung neuer Medikamente und können dazu beitragen, Therapeutika gegen SARS CoV-2 voranzubringen.
„Unsere Studie konzentriert sich darauf, wie sich COVID-19 mithilfe des NendoU-Proteins vor dem Immunsystem versteckt“, sagt Rebecca Jernigan, Erstautorin der Studie und Forscherin am Biodesign Center for Applied Structural Discovery an der Arizona State University. „Je besser wir die Struktur und Funktionsweise von NendoU verstehen, desto besser können wir uns vorstellen, wie wir antivirale Medikamente dagegen entwickeln können.“
Die Entdeckung bietet die Möglichkeit, Medikamente herzustellen, die auf Konformationsänderungen von Proteinen abzielen, wie sie in der neuen Studie beschrieben werden. Solche Therapeutika wären besonders attraktiv, da sie weniger anfällig für Arzneimittelresistenzen sind.
Das Biodesign Center for Applied Structural Discovery hat entscheidende Fortschritte bei Strukturstudien dieser Art erzielt und eine Vielzahl komplexer biologischer Strukturen gelöst. Das Zentrum wird von Petra Fromme geleitet, der leitenden Ermittlerin der Studie. Fromme ist außerdem Regents Professor an der School of Molecular Sciences der ASU.
„Diese Arbeit ist so spannend, weil sie zum ersten Mal zeigt, dass die Unterschiede in der Flexibilität des Proteins eine wichtige Rolle für den Funktionsmechanismus spielen“, sagt Fromme. „Dies wird entscheidend für die Entwicklung von Medikamenten gegen NendoU sein, die das Potenzial haben, dem Immunsystem das Vorhandensein des Virus anzuzeigen, das dann reagieren und schwere Infektionen verhindern kann.“
Virale Intrige
Viren haben komplexe Strategien entwickelt, um sich den Abwehrmechanismen des Körpers zu entziehen. Die Forschung weist auf eine Reihe von Taktiken hin, die von den virulentesten Coronaviren angewendet werden, einer Gruppe von Krankheitserregern, zu denen auch diejenigen gehören, die COVID-19 (SARS CoV-2), das schwere akute Atemwegssyndrom (SARS) und das Atemwegssyndrom des Nahen Ostens (MERS) verursachen.
Die neue Studie untersucht, wie das Protein NendoU SARS CoV-2 dabei hilft, sich vor aller Augen vor dem Immunsystem zu verstecken. Sobald ein Virus an einen Rezeptor auf der Zelloberfläche bindet, fügt es sein genetisches Material in die Zelle ein, wodurch die Zelle mehrere Kopien des viralen Genoms herstellt, die entweder aus DNA oder – im Fall von Coronaviren – aus RNA bestehen.
Wenn sich Viren wie SARS CoV-2 in Zellen replizieren, erzeugt ihre wachsende RNA-Sequenz am Ende einen Schwanz, der als Poly-U-Schwanz bekannt ist. Dieser Schwanz ist einzigartig für RNA-Viren.
Menschliche Zellen sind mit fein abgestimmten Sensoren ausgestattet, um eindringende RNA-Viren zu erkennen, da der Poly-U-Schwanz ihre Identität als fremde Eindringlinge preisgibt und es dem Immunsystem ermöglicht, sie anzugreifen. Untersuchungen haben gezeigt, dass SARS CoV-2 sein NendoU-Protein verwendet, um sich daran zu binden und dann den Poly-U-Schwanz abzuschneiden. Wenn das NendoU den Poly-U-Schwanz zerkaut, führt dies dazu, dass das Virus für das Immunsystem weniger sichtbar ist.
Meister der Verkleidung
Um die Fähigkeit von NendoU, das Virus zu verbergen, zu vereiteln, benötigen die Forscher hochauflösende Bilder der dreidimensionalen Struktur des Proteins. Bisher wurden gelöste Strukturen des NendoU-Proteins nur unter kryogenen Bedingungen mit einer als Kryo-EM bekannten Technik vervollständigt, bei der die zu untersuchende Probe schockgefroren und mit Elektronenmikroskopie oder durch Röntgenkristallographie von großen gefrorenen Proben abgebildet wird Kristalle. Dies hat wichtige Hinweise auf die genaue Natur von NendoU geliefert, aber es werden weitere Informationen benötigt, bevor ein Medikament entwickelt werden kann, das NendoU hemmt und das SARS-CoV-2-Virus einem Immun-Targeting aussetzt.
Dazu müssen die Forscher die Struktur so detailliert auflösen, dass sie wissen, wo sich jedes Atom im Protein befindet. Idealerweise würde die Struktur unter naturnahen Bedingungen bei Raumtemperatur bestimmt werden, wo Dynamik nachgewiesen werden kann. Die Schäden durch Elektronen oder Röntgenstrahlen sind jedoch so schwerwiegend, dass die Datenerfassung in den meisten Fällen unter kryogenen Bedingungen erfolgt, bei denen alle Bewegungen eingefroren sind. Um eine solche atomare Auflösung bei Raumtemperatur zu erreichen, ist eine spezielle Röntgenanlage, bekannt als XFEL (für Freie-Elektronen-Röntgenlaser), erforderlich.
In der aktuellen Studie erhielten die Forscher erste Momentaufnahmen auf dem Weg zu einer Struktur im atomaren Maßstab. Bei der als serielle Femtosekunden-Kristallographie bekannten Technik wird die Proteinprobe in Form von Milliarden kleiner Mikrokristalle kristallisiert und dann bei Raumtemperatur in einen Strahl extrem kurzer Ausbrüche starken Röntgenlichts eingebracht, wodurch eine Reihe von Zehntausenden erzeugt wird von Beugungsmustern, jeweils von einem kleinen Mikrokristall.
Die ultrakurzen Röntgenpulse mit einer Dauer von nur zehn Femtosekunden überholen die Röntgenstrahlenschäden an den Kristallen und ermöglichen die Datenerfassung bei Raumtemperatur unter nahezu physiologischen Bedingungen. Um einen Eindruck von der extrem kompakten Zeitskala dieser Röntgenblitze zu vermitteln: Eine Femtosekunde entspricht einer Billiardstel Sekunde. Computer werden verwendet, um große Mengen dieser Röntgenschnappschüsse zu kombinieren, was es Forschern ermöglicht, detaillierte 3D-Strukturen eines Proteins zu konstruieren und sein dynamisches Verhalten zu untersuchen.
Die aktuelle Studie wurde unter Verwendung von LCLS (Linac Coherent Light Source), dem einzigen Freie-Elektronen-Röntgenlaser in den USA am SLAC, unter Verwendung des makromolekularen Femtosekunden-Kristallographie-Instruments durchgeführt. Die Forscher verwendeten Femtosekunden-Röntgenkristallographie, um die Struktur des NendoU-Proteins zu entschlüsseln, während es sich an sein Substrat anklinkte. In lebenden Zellen wäre dies der Poly-U-Schwanz des RNA-Strangs, aber für die Studie wurde ein kleineres Molekül namens Citrat in der RNA-Bindungsstelle gefunden.
„Es war aufregend, zu einem Experiment am LCLS eingeladen zu werden“, sagt Sabine Botha, Mitautorin der Studie und Projektleiterin für Datenanalyse. „Sie hatten gerade eine lange Abschaltphase hinter sich und wurden mitten in der Pandemie mit einem Aufruf zur Einreichung von Vorschlägen für SARS-CoV-2 wiedereröffnet. Es war ein sehr herausforderndes Experiment mit einem brandneuen Röntgendetektor, aber auch sehr lohnend. „
NendoU in den Fokus rücken
Einer der Vorteile von Strukturstudien mit XFELs besteht darin, dass biologische Phänomene nahe an ihrem natürlichen physiologischen Zustand untersucht werden können. Die aktuellen Ergebnisse zeigen, dass die Raumtemperaturstruktur des NendoU-Proteins flexibler ist als die kryogene Struktur. Dies ist wahrscheinlich eine getreuere Darstellung im Vergleich zu den zuvor identifizierten „eingefrorenen“ Strukturen.
„Wie bei den vorherigen Strukturen haben wir auch gesehen, dass NendoU ein Hexamer bildet (sechs identische NendoU-Proteine, die aneinander gebunden sind)“, sagt Debra Hansen, Co-Autorin der Veröffentlichung und außerordentliche Forschungsprofessorin am Zentrum. Darüber hinaus fanden die Forscher heraus, dass eine Hälfte des Proteins flexibler war als die andere Hälfte, die starrer war.
Die vom XFEL-Licht enthüllten strukturellen Details zeigen, dass NendoU durch einen zweistufigen Prozess wirkt. Zunächst bindet die starrere Hälfte des Proteins an das aktive Zentrum des Substrats (in diesem Fall das Citratmolekül). Die flexible Hälfte des Hexamers bindet auch Citrat (oder die RNA), aber weniger fest. Sobald die starre Hälfte die Aufgabe erfüllt, den RNA-Strang zu spalten, gibt sie den Strang frei. Diese starre Hälfte wird dann flexibel, während die flexible Hälfte in einen starren Zustand wechselt und der Zyklus wiederholt wird. Diese scherenartige Bewegung der beiden Hauptkomponenten von NendoU trägt dazu bei, das verräterische Signal der Anwesenheit des Virus in der Zelle zu löschen und die Immunantwort zu deaktivieren.
Die XFEL-Schnappschüsse dieser Bewegungen liefern eine detaillierte Karte für das mögliche Arzneimitteldesign. Zukünftige Strukturen, die Raumtemperaturbedingungen verwenden, werden diese verschiedenen Bewegungen abbilden, und jede Karte wird das genaueste rechnerische Design von Medikamenten zur Bekämpfung von COVID ermöglichen.
Das Projekt umfasste die Ressourcen und Talente vieler Forschungsgruppen und mehr als 30 Mitarbeiter. Neben dem Biodesign Center for Applied Structural Discovery, der School of Molecular Sciences der ASU, dem Department of Physics und der Fulton School of Electrical, Computer and Energy Engineering, zählen die University of Buffalo; Universität von Wisconsin-Milwaukee; das Deutsche Elektronen-Synchrotron, Hamburg; Spanischer Nationaler Forschungsrat, Madrid; und Lawrence Livermore National Laboratory.
Mehr Informationen:
Rebecca J. Jernigan et al, Raumtemperatur-Strukturstudien des SARS-CoV-2-Proteins NendoU mit einem Freie-Elektronen-Röntgenlaser, Struktur (2023). DOI: 10.1016/j.str.2022.12.009