Reaktive Mikroskopie mit MicroMator-Software

Die mikroskopische Bildanalyse ist ein entscheidender Bestandteil der Biochemie und Medizin, mit erheblichen Fortschritten in Genauigkeit und Geschwindigkeit, die durch maschinelle Lernmethoden und verbesserte Berechnungen erzielt wurden. Diese technischen Fortschritte können Forscher dabei unterstützen, Mikroskopie-Versuchspläne online anzupassen, um Echtzeitinformationen über experimentelle Beobachtungen zu erhalten. In einer neuen Studie, die jetzt in veröffentlicht wurde NaturkommunikationZachary R. Fox und ein Team interdisziplinärer Wissenschaftler in Frankreich und den USA haben MicroMator entwickelt – eine offene und flexible Software, die in integriert ist Python reaktive Mikroskopie-Experimente voranzutreiben. Unter Verwendung des experimentellen Rahmens führten sie eine dynamische Anpassung der Fluoreszenzmikroskopie an Bakterien durch, um das Potenzial von MicroMator für Echtzeit-Verfolgungs- und Targeting-Experimente auf Einzelzellebene in zwei primären Fallstudien zu demonstrieren.

Software für reaktive Mikroskopie

Mikroskopieautomatisierung kann sein mit intelligenter Software geregelt um reproduzierbare Hochdurchsatz-Mikroskopieexperimente zu unterstützen. Viele dieser Experimente können jedoch nicht durch menschliche oder computergesteuerte Eingriffe geändert werden, während das Experiment läuft. Beispielsweise muss ein Forscher während eines reaktiven Experiments möglicherweise den Autofokus während des Fokusverlusts auslösen, seltene Ereignisse erkennen und die Bildgebungsroutine anpassen oder sogar eine E-Mail senden, um die Erkennung interessanter Anomalien hervorzuheben, die ein ungeplantes menschliches Eingreifen erfordern. Während die bildgebende Analysetechnologie große Sprünge gemacht hat Deep-Learning-Software, muss der volle Umfang der Mikroskopieautomatisierung noch erforscht werden. In dieser Arbeit stellten Fox et al. MicroMator vor, eine Software, die reaktive Mikroskopie-Experimente unterstützt, und untersuchten zwei Fallstudien als Proof-of-Concept.

Implementierung der MicroMator-Software

Während der Experimente verwendete das Team MicroMator, um mikroskopische Analysen über eine Hauptbilderfassungsschleife zu definieren, die als Rückgrat für Experimente diente, um Funktionen zu erstellen und Reaktivität zu implementieren. Infolgedessen modifizierte das Team die Haupterfassungsschleife im Laufe des Experiments relativ zu Ereigniseffekten. Sie entwarfen die Software unter Verwendung von Python 3, einem Open-Source-Algorithmus mit modularem Design, wobei MicroMator eine Befehlszeilensoftware zum Lesen von Konfigurationsdateien bereitstellte, die die reaktiven Experimente definieren. MicroMator enthielt auch vom Micro-Manager generierte Dateien, um die interessierenden Positionen während des Experiments anzugeben. Das Team erstellte nach jeder Bilderfassung Ereignisse, um hochkomplexe Experimente zu konzipieren. Sie benötigten zunächst Python-Programmierkenntnisse, um die Software zu entwickeln, um Fehler zu beheben, zu warten und wiederzuverwenden. Während der Studie entwarfen Fox et al. Experimente, um zelluläre Prozesse in Echtzeit zu regulieren, inspiriert von vorherige Studien.

Fallstudien: Echtzeit-Experimente in Bakterien

Unter Verwendung des experimentellen Aufbaus untersuchten Fox et al Corynebacterium glutamicum Stämme, ein Modellorganismus zum Verständnis von Mycobacterium tuberculosis. Nach Züchten der interessierenden Zellen auf Agarpads wurden die Zellen exprimiert Zellzyklusmarker Wag31 an das fluoreszierende Protein fusioniert mNeonGrün und der Nilroter lipolytischer Farbstoff der Zellmembran.

Typischerweise kann die Komplexität des Experiments über unterschiedliche Erfassungseinstellungen für unterschiedliche Zeiträume überwacht werden, aber in diesem Fall haben Fox et al. zur Überwindung solcher Herausforderungen MicroMator eingeschlossen, um gezielte Fluoreszenzwerte für die roten und grünen Kanäle zu erzielen, und eine Reihe davon erfasst von Positionen und deren jeweilige Exposition während der Experimente. Anschließend maß das Team die intrazelluläre Fluoreszenz, um eine zeitkritische Bakteriensegmentierung durchzuführen über Cellpose– ein auf Deep Learning basierender generalistischer Algorithmus. In der zweiten Fallstudie verwendete das Team eine optogenetisches System und der mScarlet1-Fluoreszenzreporter um auf Licht ansprechende Hefezellen aufzubauen. Dazu stimulierte das Team verschiedene Zellen im Sichtfeld über a digitales Mikrospiegelgerät mit Echtzeit-Bildgebungssegmentierung und Zellverfolgungsfunktionen zur Regulierung der Proteinexpressionsniveaus in einer Zellpopulation. Fox et al. verwendeten die im Setup verfügbare SegMator-Bildanalyse, um Zellen im Sichtfeld in Echtzeit zu segmentieren und zu verfolgen, und schätzten die Fluoreszenzzeit der Reportererkennung, um die Verzögerung zwischen Zellstimulation und Fluoreszenzerkennung während des Experiments zu berücksichtigen. In der dritten Fallstudie konstruierten Fox et al. einen lichtbetriebenen künstliches Rekombinationssystem in Hefe und verwendeten verschiedene Lichtstimulationsstrategien, um verschiedene Strukturen rekombinierter Zellen zu erhalten. Die Arbeit zeigte, wie einige Zellen fälschlicherweise für die Rekombination anvisiert wurden, und verifizierte die Notwendigkeit einer reaktiven Software für die Echtzeit-Bildanalyse bei Einzelzellauflösung.

Ausblick

Auf diese Weise stellten Zachary R. Fox und Kollegen die MicroMator-Software vor, um automatisierte Mikroskopieplattformen dabei zu unterstützen, ihr volles Potenzial auszuschöpfen. Die Plattform kann zur Durchführung hochkomplexer Experimente verwendet werden, das Team erwartet jedoch, in erster Linie klassische Experimente zu automatisieren, um die Reaktivität in der Mikroskopie hervorzuheben. Die MicroMator-Software ist relativ einfach und in den meisten quantitativen Biologielabors weltweit anwendbar.

© 2022 Science X Netzwerk