Quantifizierung genetischer Variationen in Bakterienkulturen auf die qSanger-Art

Genetische Variationen wie Mutationen, Rekombinationen oder Transpositionen treten natürlicherweise in kultivierten Mikroorganismen auf und werden oft als nicht neutrale Mutationen betrachtet.

Neutrale Mutationen sind weder vorteilhaft noch schädlich für einen Organismus und betreffen nur einen kleinen Teil der Gesamtbevölkerung. Andererseits können nichtneutrale Mutationen einen größeren Teil der Bevölkerung betreffen, indem sie möglicherweise den Genpool verändern, abhängig von den Vor- oder Nachteilen, die die genetische Variante bietet. Diese Mutationen können mit verschiedenen Sequenzierungsmethoden genotypisch quantifiziert werden.

Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gilt als effektive Sequenzierungsmethode zur Messung individueller genetischer Varianten. Es kann jedoch teuer und zeitaufwändig sein. Im Gegensatz dazu ist die Sanger-Sequenzierung schnell und kostengünstig, aber ihre Genauigkeit ist bei der Quantifizierung von Mutationen in Plasmidmischungen, die aus einer heterogenen Population stammen, unzureichend.

Da neutrale Mutationen aufgrund sich ändernder Umweltbedingungen dominant werden können, was zu einer vorübergehenden Selektion oder Gegenselektion führt, ist es wichtig, die Verhältnisse von mutierten und Wildtyp-DNA-Sequenzen genau zu bestimmen. Darüber hinaus könnte eine solche DNA-Quantifizierung die Früherkennung von Krankheiten und die effektive Arzneimittelentwicklung verbessern. Folglich hat ein Team von Forschern aus Europa eine neuartige Methode – qSanger – entwickelt, um genetische Varianten zu quantifizieren und neutrale/nichtneutrale Mutationen zu identifizieren.

„Die in unserer Studie vorgeschlagene qSanger-Methodik verwendet Daten aus der Sanger-Sequenzierung, um das Verhältnis genetischer Variationen in einer Bakterienkultur zu messen“, sagt Prof. Alfonso Jaramillo, der der University of Warwick und der Keele University angehört und korrespondierender Autor der ist lernen.

Die Studie wurde veröffentlicht in BioDesign-Forschung.

Zunächst verwendete das Team Top 10 kompetente Zellen von Escherichia coli (E. coli), die in Gegenwart von Antibiotika aerob kultiviert wurden. Die Bakterienkolonien wurden mit zwei Plasmiden – P1 und P2 – cotransformiert. Als nächstes verwendeten sie die Sanger-Sequenzierung, um ein Elektropherogramm mit mehreren Spuren für die mit P1 und P2 co-transformierten Bakterienkolonien zu erstellen. Die zwei Plasmide wurden auch einzeln sequenziert.

Danach wurden Spuren von den P1- und P2-Sequenzen mit den gemischten P1:P2-Spuren ausgerichtet. Schließlich wandten sie die qSanger-Methode an, um die Plasmid-DNA zu quantifizieren, indem sie Amplitudenverhältnisse der ausgerichteten Elektropherogramm-Peaks aus gemischten Sanger-Sequenzierungs-Reads verwendeten.

Um die Plasmidverhältnisse einfach zu messen, verwendete das Team unterschiedliche fluoreszierende Marker mit zwei Plasmidkonstrukten – mCherry (rot) im P1-Plasmid und verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) im P2-Plasmid. Diese fluoreszenzexprimierenden Plasmide trugen auch dazu bei, die qSanger-Methode sowohl in vitro als auch in co-transformierten Bakterien unter Verwendung von Standard-DNA-Quantifizierungsmethoden zu validieren.

Zunächst validierten sie die qSanger-Methode, indem sie das Plasmid-DNA-Verhältnis in verschiedenen Mischungen von reinen P1- und P2-Zellen maßen. Als nächstes wertete das Team die P1:P2-Verhältnisse in co-transformierten E. coli-Zellen mithilfe von qPCR und Fluoreszenzquantifizierung aus. In beiden Fällen korrelierte das mit der qSanger-Methode berechnete P1:P2-Verhältnis mit den anderen Plasmid-DNA-Verhältnissen.

Diese Ergebnisse demonstrieren die Genauigkeit der qSanger-Methode bei der Quantifizierung genetischer Varianten in Zellen aus gemischten Sanger-Sequenzen und belegen, dass ihre Wirksamkeit mit anderen DNA-Quantifizierungsansätzen vergleichbar ist. Was diese Methode jedoch von Technologien wie qPCR und digitaler Tröpfchen-PCR abhebt, sind ihre Benutzerfreundlichkeit und die deutlich reduzierten Kosten und der Arbeitsaufwand.

In Bezug auf die potenziellen Anwendungen dieses neuartigen Ansatzes sagt Prof. Jaramillo: „Unsere Methodik könnte verwendet werden, um Mutanten/Nicht-Mutanten-DNA-Verhältnisse in Zellpopulationen nach verschiedenen Implementierungen der Genbearbeitung zu analysieren, einschließlich Basis-Editierung, Prime-Editierung und Promoter-Engineering durch Multiplex-Automatisierung Genom-Engineering. Darüber hinaus könnte es in Anwendungen eingesetzt werden, die die Quantifizierung mehrerer DNA- oder RNA-Sequenzen in derselben Mischung erfordern.“

Angesichts der wachsenden Anwendungen der DNA-Sequenzierung in verschiedenen Bereichen könnte die qSanger-Methodik die Grenze für genaue, zeitsparende und kostengünstige DNA-Bewertungen sprengen.