Phagendisplay-Technologie verbessert effektiv die spezifische Zielfähigkeit antimikrobieller Peptide gegen S. aureus

Antibiotika werden in der klinischen Behandlung und Tierproduktion häufig als wirksames Mittel zur Bekämpfung mikrobieller Infektionen eingesetzt. Antimikrobielle Peptide haben als mögliche Alternativen zu Antibiotika vielversprechende Anwendungsmöglichkeiten gezeigt. Aufgrund ihrer antimikrobiellen Breitbandwirkung neigen die meisten antimikrobiellen Peptide jedoch dazu, die Darmflora des Wirts aus dem Gleichgewicht zu bringen. Darüber hinaus kann die systemische Anwendung von Breitbandmedikamenten zur Behandlung lokaler Infektionen zu Toxizität führen, die nicht übersehen werden sollte.

Bei der Phagendisplay-Technologie werden DNA-Fragmente, die exogene Proteine ​​oder niedermolekulare Polypeptide kodieren, mit Phagengenen fusioniert, die Oberflächenproteine ​​kodieren. Diese Moleküle werden dann in Form von Fusionsproteinen auf der Oberfläche von Phagen gelagert. Exogene Proteine ​​und niedermolekulare Polypeptide erkennen und binden spezifisch an Zielmoleküle. Daher wird diese Technologie häufig eingesetzt, um zielgerichtete Medikamente zu screenen, Impfstoffe und monoklonale Antikörper herzustellen und Tumore zu überwachen und zu diagnostizieren.

In einer neuen Studie haben Forscher neun Heptapeptidsequenzen aus einer zufälligen Peptidbibliothek mithilfe der Phagendisplay-Technologie gescreent, wobei S. aureus 6538 das Zielbakterium war. Die Arbeit ist veröffentlicht im Journal mLeben.

Die Heptapeptidsequenz mit der höchsten Affinität (SYWVRAS) wurde als Zieldomäne ausgewählt. Die Forscher verbesserten ihre antimikrobielle Aktivität weiter, indem sie mehrere kationische Aminosäuren (R oder K) am C-Terminus hinzufügten, nachdem sie die Heptapeptidsequenz über GGG als Linker mit Temporin-SHf verknüpft hatten, das reich an hydrophoben Aminosäuren ist. Im Vergleich zu Temporin-SHf hatte das entworfene Peptid eine höhere spezifische antimikrobielle Aktivität gegen S. aureus. Dies deutet darauf hin, dass die gescreente Heptapeptidsequenz die spezifische antimikrobielle Aktivität nach Verkettung mit dem Template-Peptid effektiv verbessert.

Um die Wirkung der SFK2-Behandlung auf die Membranintegrität weiter zu verifizieren, wurde S. aureus 6538 mit einer Endkonzentration von 8 μM SFK2 inkubiert und die Fluoreszenzverteilung unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop beobachtet. Die grüne Fluoreszenz (SYTO9) und die rote Fluoreszenz (PI) von S. aureus ATCC 6538, die unter 8 μM SFK2 induziert wurden, überlappten sich, was auf eine schwere Störung der Zellmembran hindeutet und zum Zelltod führt.

Um anschließend die Zielfähigkeit von SFK2 zu untersuchen, wurden S. aureus ATCC 6538 und E. coli ATCC 25922 1:1 gemischt, mit 8 μM SFK2 behandelt und dann wurden SYTO9- und PI-Fluoreszenzfarbstoffe zur Beobachtung mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie hinzugefügt. Die grüne und rote Fluoreszenz von S. aureus ATCC 6538 wurden bei einer Konzentration von 8 μM SFK2 zur Überlappung gebracht, während E. coli ATCC 25922 nur grüne Fluoreszenz ohne rote Fluoreszenz emittierte, was darauf hindeutet, dass seine Membranintegrität nicht gestört war.

S. aureus, P. aeruginosa und E. coli wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von SFK2 inkubiert und ihre Membranintegrität wurde mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. 8, 4 und 2 μM SFK2 induzierten eine S. aureus-Mortalität von 92,78 %, 70,08 % bzw. 28,38 %. P. aeruginosa und E. coli überlebten jedoch selbst bei der Endkonzentration von 8 μM SFK2 mehr als 90 %, wobei die Unterschiede zur Kontrollgruppe vernachlässigbar waren.

Um diese Hypothese weiter zu verifizieren, wurden ein Rasterelektronenmikroskop (SEM) und eine Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet, um die morphologischen Veränderungen bei mit SFK2 behandeltem S. aureus zu beobachten. Die Oberfläche des unbehandelten S. aureus war unter dem SEM intakt und glatt gerundet. S. aureus riss nach 2-stündiger Behandlung mit 2 μM SFK2 auf und der Inhalt floss aus der Zelle heraus. Unter dem TEM war die Zellmembranstruktur von S. aureus in der Kontrollgruppe vollständig und das Zytoplasma dicht. Nach der Behandlung mit 2 μM SFK2 für 2 Stunden riss die Zellmembran von S. aureus auf und der Zellinhalt wurde entladen.

Die Forscher konstruierten und bewerteten ein Mausmodell für eine systemische Infektion mit intraperitonealen und Schwanzveneninjektionen. Beide Verabreichungsarten reduzierten die Anzahl der Kolonien in den Organen erheblich, und Symptome wie Leberzellruptur und Infiltration entzündlicher Zellen wurden im Vergleich zur Kochsalz-Kontrolle drastisch reduziert. Da Ferkel dem Menschen in Bezug auf Anatomie, Physiologie und Nährstoffstoffwechsel ähnlich sind, validierte das Team die In-vivo-Wirkungen von SFK2 anhand von Ferkeln als Modell weiter. Es zeigte sich, dass SFK2 in vivo in einem Ferkelmodell zur Behandlung einer S. aureus-Infektion aktiv blieb.

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die mittels Phagendisplay-Technologie gescreente Heptapeptidsequenz die spezifische Zielfähigkeit des Peptids gegen S. aureus wirksam verbessern kann und damit eine Referenz für die nachfolgende Entwicklung antibakterieller Medikamente mit schmalem Wirkungsspektrum bietet.