Forscher des Shenzhen Institute of Advanced Technology der Chinesischen Akademie der Wissenschaften haben einen kombinatorischen Optimierungsansatz entwickelt, um ein Cytochrom-P450-Cytochrom-P450-Reduktase-Netzwerk (CYP-CPR) in einem manipulierten Saccharomyces-cerevisiae-Stamm aufzubauen und räumlich zu steuern, um die Quillainsäureproduktion zu steigern.
Die Studie wurde veröffentlicht in Stoffwechseltechnik am 12. September.
Cytochrom P450 (CYPs) spielen in der Natur eine vielseitige Rolle, was sie zu einem wichtigen Werkzeug in der synthetischen Biologie für den Aufbau mikrobieller Zellfabriken zur Herstellung kommerziell wertvoller Arzneimittel wie Saponine macht. Allerdings weisen CYPs eine Substratpromiskuität auf und oxidieren unbeabsichtigte Substrate, was zur Akkumulation von unteroxidierten oder überoxidierten Produkten führt, die von anderen co-exprimierten CYPs nicht erkannt werden.
Quillainsäure ist das Aglycon-Rückgrat für 49 von 58 in Quillaja saponaria Molina identifizierten Saponinen, von denen einige als Adjuvantien in Malaria-, Gürtelrose- und COVID-19-Impfstoffen verwendet wurden.
Die De-novo-Biosynthese von Quillainsäure in einer mikrobiellen Zellfabrik erfordert mehrere CYPs, um die sechsstufige Oxidation an drei verschiedenen Positionen zu katalysieren. Die Aufrechterhaltung der absoluten Synergie der Oxidationsschritte ist von entscheidender Bedeutung, da während des Prozesses 47 verschiedene Produkte entstehen könnten, von denen 46 entweder unvollständige oder überoxidierte Nebenprodukte sind.
In dieser Studie bauten die Forscher durch iteratives Screening von mehr als 100 CYP-CPR-Paaren ein effizientes Netzwerk von CYPs und CPRs auf, um das Zielprodukt Quillainsäure herzustellen.
Der räumliche Abstand zwischen verschiedenen CYPs auf dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Expression des Membransteroid-bindenden Proteins 1 aus Arabidopsis thaliana kontrolliert, was den Quillainsäuretiter um 79,5 % erhöhte.
Sie optimierten das Enzymnetzwerk in der mikrobiellen Zellfabrik, indem sie die Co-Faktor-Versorgung stärkten und die Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums vergrößerten. Von den 47 potenziellen Produkten, die synthetisiert werden konnten, waren 86 % der durch das optimierte Enzymnetzwerk synthetisierten Produkte die Zielverbindung Quillainsäure, und die Fermentation erreichte 2,23 g/L Quillainsäure.
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Jiazeng Yang et al., Kombinatorische Optimierung und räumliche Umgestaltung von CYPs zur Kontrolle des Produktprofils, Stoffwechseltechnik (2023). DOI: 10.1016/j.ymben.2023.09.004