Nukleosidanaloga für die metabolische Markierung und Sequenzierung von Messenger-RNA

Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (RNA-seq) wird häufig verwendet, um die globale zelluläre Genexpression zu profilieren und Einblicke in zelluläre biologische Prozesse zu gewinnen; Die effektive Verfolgung dynamischer Veränderungen der zellulären mRNA-Expression bleibt jedoch eine Herausforderung. Dies kann Forschern dabei helfen, Transkripte über einen längeren Zeitraum hinweg zu untersuchen.

In einer in der Zeitschrift veröffentlichten Studie Grundlegende Forschunghat ein Forscherteam eine neuartige Methode entwickelt. Es baute ein Adenosin-Analogon, N6-Allyladenosin (a6A), über Nukleosid-Salvage-Wege in neu transkribierte RNAs ein.

Nach der metabolischen Markierung verwendeten die Forscher eine chemische Jodierungsbehandlung, um a6A in den Transkripten in eine eindeutige Variantenstruktur umzuwandeln. Diese veränderte Struktur kann dann mithilfe der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie genau als Basenmutationsstellen identifiziert werden.

„Wir glauben, dass immer mehr Nukleosidanaloga für die Verwendung als chemische Sequenzierungsmarkierungen untersucht werden, in der Hoffnung, eine spezifische Markierung verschiedener Arten von RNA, insbesondere mRNA, zu erreichen“, sagt Jianzhao Liu, korrespondierender Autor der Studie und Professor an der Universität das Institut für biologische Makromoleküle am Department of Polymer Science and Engineering der Zhejiang University.

Das Team fand heraus, dass a6A von der RNA-Polymerase erkannt und in die neu synthetisierte zelluläre mRNA eingebaut werden kann. Währenddessen wird die Allylgruppe an a6A bioorthogonal mit Jod behandelt und a6A in eine Struktur aus 1,N6-zyklisiertem Adenosin umgewandelt. Folglich induziert diese Modifikation eine Basenfehlpaarung während der reversen RNA-Transkription, was zur Erzeugung von A-zu-C/T-Mutationsablesungen in der nachfolgenden RNA-Seq-Analyse führt.

Derzeit ist ein für die Immunpräzipitation a6A-haltiger RNA geeigneter Antikörper kommerziell erhältlich. Unter Nutzung dieser Ressourcen verwendeten die Forscher a6A bei ihrer Untersuchung von Veränderungen in zellulären Genexpressionsprofilen unter methioninfreien Bedingungen. Darüber hinaus nutzten sie a6A-IP als Validierungstool, um die durch Sequenzierung gewonnenen Erkenntnisse zu bestätigen. Dieser integrierte Ansatz ermöglichte eine umfassende und zuverlässige Analyse der Genexpressionsdynamik.

„Unsere Technik wird es Forschern ermöglichen, die neu gebildeten a6A-haltigen Transkripte zu verfolgen und die Dynamik dieser Transkripte, einschließlich RNA-Synthese und -Zerfall, zu untersuchen“, sagt Liu. „a6A bietet nicht nur eine chemische Markierung für die Sequenzierung, sondern auch eine Markierung für die Antikörperanreicherung.“