Ein Team von Ingenieuren der Duke University hat eine Methode entwickelt, um die Reichweite der CRISPR-Technologien zu erweitern. Während das ursprüngliche CRISPR-System nur auf 12,5 % des menschlichen Genoms abzielen konnte, erweitert die neue Methode den Zugang zu nahezu jedem Gen, um potenziell ein breiteres Spektrum von Krankheiten durch Genom-Engineering zu bekämpfen und zu behandeln.
An der Forschung waren Mitarbeiter der Harvard University, des Massachusetts Institute of Technology, der University of Massachusetts Medical School, der Universität Zürich und der McMaster University beteiligt.
Diese Arbeit war veröffentlicht am 5. Dezember in der Zeitschrift Naturkommunikation.
CRISPR-Cas ist ein bakterielles Immunsystem, das es Bakterien ermöglicht, RNA-Moleküle und CRISPR-assoziierte (Cas) Proteine zu nutzen, um die DNA eindringender Viren anzugreifen und zu zerstören. Seit seiner Entdeckung haben Forscher eifrig daran gearbeitet, ein Arsenal neuer CRISPR-Systeme für Anwendungen in der Gentherapie und Genomtechnik zu entwickeln.
Um Änderungen am Genom vorzunehmen, nutzen Cas-Proteine sowohl ein RNA-Molekül, das das Enzym zu einem Ziel-DNA-Abschnitt führt, als auch ein Protospacer-Adjacent-Motiv oder PAM, eine kurze DNA-Sequenz, die unmittelbar auf die Ziel-DNA-Sequenz folgt für die Bindung des Cas-Proteins erforderlich.
Sobald eine Leit-RNA ihre komplementäre DNA-Sequenz findet und das Cas-Enzym das angrenzende PAM bindet, wirkt das Enzym wie eine Schere, um einen Schnitt in die DNA zu machen und die gewünschten Veränderungen im Genom auszulösen. Das am weitesten verbreitete CRISPR-Cas-System ist das Cas9 aus Streptococcus pyogenes-Bakterien (SpCas9), das eine PAM-Sequenz aus zwei Guaninbasen (GG) hintereinander erfordert.
In früheren Arbeiten verwendeten Chatterjee und sein Team bioinformatische Werkzeuge, um neue Cas9-Proteine zu entdecken und zu konstruieren, darunter Sc++, für dessen Schnitt nur ein einziges Guanin-Base-PAM erforderlich ist. Diese Änderung ermöglichte es Forschern, fast 50 % aller DNA-Sequenzen zu bearbeiten.
Gleichzeitig entwickelten Chatterjees Mitarbeiter in Harvard unter der Leitung von Benjamin Kleinstiver, einem Assistenzprofessor an der Harvard Medical School, eine separate Variante namens SpRY. Während SpRY an jede der vier DNA-Basen binden konnte, die das PAM bilden könnten, hatte es eine viel stärkere Affinität zu Adenin und Guanin.
Da beide Systeme Nachteile hatten, beschloss die Gruppe, das Beste aus beiden in einer neuen Variante namens SpRyc zusammenzuführen.
„CRISPR ist ein großartiges Tool zum Bearbeiten spezifischer DNA, aber wir sind immer noch eingeschränkt, welche Gene wir bearbeiten können. Das ursprüngliche CRISPR-Tool konnte nur etwa 12,5 % aller DNA-Sequenzen bearbeiten, je nachdem, wo sich dieser spezifische Spacer befand. Wenn es Ihnen passiert Wenn es bei den anderen 87,5 % eine Mutation gäbe, hätte man Pech gehabt. Mit diesem neuen Tool können wir nahezu 100 % des Genoms viel präziser anvisieren“, sagte Chatterjee.
Während SpRYc beim Schneiden von Ziel-DNA-Sequenzen langsamer war als seine Gegenstücke, war es bei der Bearbeitung bestimmter DNA-Abschnitte effektiver als die beiden herkömmlichen Enzyme. Trotz der Breite von SpRYc war es auch genauer als SpRY.
Nachdem die Bearbeitungsmöglichkeiten von SpRYc etabliert waren, untersuchte das Team die potenziellen therapeutischen Einsatzmöglichkeiten des Tools für genetische Krankheiten, die mit dem Standard-CRISPR-System nicht behandelbar waren. Ihr erster Test war das Rett-Syndrom, eine fortschreitende neurologische Erkrankung, die vor allem junge Frauen betrifft und durch eine von acht Mutationen in einem bestimmten Gen verursacht wird.
Die zweite war die Huntington-Krankheit, eine seltene, erbliche neurologische Erkrankung, die zur Degeneration von Neuronen im Gehirn führt. Das Team fand heraus, dass SpRYc in der Lage war, zuvor unzugängliche Mutationen zu verändern, was potenzielle therapeutische Möglichkeiten für beide Krankheiten eröffnete.
„SpRYc bietet großes Potenzial, sei es bei der Erforschung, wie es in die Klinik übertragen werden kann, oder bei der Suche nach Möglichkeiten, es noch effizienter zu machen“, sagte Chatterjee. „Wir freuen uns darauf, die vollen Möglichkeiten unseres Tools zu erkunden.“
Mehr Informationen:
Tao Qi et al., Phagen-unterstützte Entwicklung kompakter Cas9-Varianten, die auf ein einfaches NNG-PAM abzielen, Naturchemische Biologie (2023). DOI: 10.1038/s41589-023-01481-5