CRISPR/Cas-Systeme haben im letzten Jahrzehnt enorme Fortschritte gemacht. Die Einsatzmöglichkeiten dieser präzisen Werkzeuge zur Genombearbeitung reichen von der Entwicklung transgener Nutzpflanzen bis hin zur Gentherapie und darüber hinaus. Und mit ihrer jüngsten Entwicklung von CRISPR-COPIES verbessern Forscher am Center for Advanced Bioenergy and Bioproducts Innovation (CABBI) die Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit von CRISPR weiter.
„CRISPR-COPIES ist ein Tool, das schnell geeignete chromosomale Integrationsstellen für die Gentechnik in jedem Organismus identifizieren kann“, sagte Huimin Zhao, CABBI Conversion Theme Leader und Steven L. Miller Chair of Chemical and Biomolecular Engineering (ChBE) an der University of Illinois .
„Es wird unsere Arbeit im Metabolic Engineering von Nicht-Modellhefen für die kostengünstige Produktion von Chemikalien und Biokraftstoffen beschleunigen.“
Die Bearbeitung von Genen hat die Fähigkeiten von Wissenschaftlern, genetische Informationen zu verstehen und zu manipulieren, revolutioniert. Diese Form der Gentechnik ermöglicht es Forschern, einem Organismus neue Eigenschaften zu verleihen, beispielsweise die Resistenz gegen Schädlinge oder die Fähigkeit, eine wertvolle Biochemikalie zu produzieren.
Mit CRISPR/Cas-Systemen können Forscher präzise und gezielte genetische Veränderungen vornehmen. Das Auffinden optimaler Integrationsstellen im Genom für diese Bearbeitungen war jedoch ein kritisches und weitgehend ungelöstes Problem. Wenn Forscher in der Vergangenheit feststellen mussten, wo sie ihre Änderungen vornehmen sollten, suchten sie in der Regel manuell nach potenziellen Integrationsstellen und testeten die Stelle dann durch die Integration eines Reportergens, um deren zelluläre Fitness und Genexpressionsniveaus zu beurteilen. Es ist ein zeit- und ressourcenintensiver Prozess.
Um dieser Herausforderung zu begegnen, entwickelte das CABBI-Team CRISPR-COPIES, eine Computer-Pipeline zur Identifizierung von CRISPR/Cas-unterstützten Integrationsstellen. Dieses Tool kann innerhalb von zwei bis drei Minuten genomweite neutrale Integrationsstellen für die meisten Bakterien- und Pilzgenome identifizieren.
„Das manuelle Finden der Integrationsstelle im Genom ist wie die Suche nach der Nadel im Heuhaufen“, sagte Aashutosh Boob, ein ChBE-Doktorand. Student an der University of Illinois und Hauptautor der Studie. „Mit CRISPR-COPIES verwandeln wir jedoch den Heuhaufen in einen durchsuchbaren Raum und ermöglichen es Forschern, alle Nadeln, die ihren spezifischen Kriterien entsprechen, effizient zu lokalisieren.“
In ihrem Artikel veröffentlicht in Nukleinsäureforschung, demonstrierten die Forscher die Vielseitigkeit und Skalierbarkeit von CRISPR-COPIES, indem sie Integrationsstellen in drei verschiedenen Arten charakterisierten: Cupriavidus necator, Saccharomyces cerevisiae und HEK 293T-Zellen. Sie nutzten die von CRISPR-COPIES gefundenen Integrationsstellen, um Zellen mit erhöhter Produktion von 5-Aminolävulinsäure zu konstruieren, einer wertvollen Biochemikalie, die in der Landwirtschaft und der Lebensmittelindustrie Anwendung findet.
Darüber hinaus hat das Team eine erstellt benutzerfreundliche Weboberfläche für CRISPR-COPIES. Diese unglaublich zugängliche Anwendung kann von Forschern auch ohne nennenswerte Bioinformatik-Kenntnisse genutzt werden.
Ein Hauptziel von CABBI ist die Entwicklung von Nichtmodellhefen zur Herstellung von Chemikalien und Kraftstoffen aus pflanzlicher Biomasse. Die wirtschaftliche Produktion von Biokraftstoffen und Bioprodukten aus kostengünstigen Rohstoffen in großem Maßstab ist jedoch eine Herausforderung, da es an genetischen Werkzeugen mangelt und traditionelle Methoden zur Genombearbeitung umständlich sind.
Indem es Forschern ermöglicht, genomische Loci für eine gezielte Genintegration schnell zu lokalisieren, bietet CRISPR-COPIES eine optimierte Pipeline, die die Identifizierung stabiler Integrationsstellen im gesamten Genom erleichtert. Außerdem entfällt die manuelle Arbeit, die beim Entwerfen von Komponenten für die CRISPR/Cas-vermittelte DNA-Integration erforderlich ist.
Im Pflanzenbau kann das Tool zur Steigerung der Biomasseerträge, der Schädlingsresistenz und/oder der Umweltresistenz eingesetzt werden. Für die Umwandlung von Biomasse in wertvolle Chemikalien – beispielsweise durch die Verwendung der Hefe S. cerevisiae – können mit CRISPR-COPIES Zellen mit deutlich höheren Erträgen manipuliert werden.
Diese vielseitige Software wurde entwickelt, um den Dehnungskonstruktionsprozess zu vereinfachen und zu beschleunigen und Forschern Zeit und Ressourcen zu sparen. Forscher auf der ganzen Welt in Wissenschaft und Industrie können von seinem Nutzen bei der Stammtechnik für die biochemische Produktion und die Entwicklung transgener Pflanzen profitieren.
Mehr Informationen:
Aashutosh Boob et al, CRISPR-COPIES: Eine In-silico-Plattform zur Entdeckung neutraler Integrationsstellen für die CRISPR/Cas-erleichterte Genintegration, Nukleinsäureforschung (2024). DOI: 10.1093/nar/gkae062