Aufbauend auf dem CRISPR-Geneditierungssystem haben MIT-Forscher ein neues Tool entwickelt, das fehlerhafte Gene herausschneiden und auf sicherere und effizientere Weise durch neue ersetzen kann.
Mit diesem System zeigten die Forscher, dass sie Gene mit einer Länge von bis zu 36.000 DNA-Basenpaaren an mehrere Arten menschlicher Zellen sowie an Leberzellen in Mäusen liefern können. Die neue Technik namens PASTE könnte vielversprechend für die Behandlung von Krankheiten sein, die durch defekte Gene mit einer großen Anzahl von Mutationen verursacht werden, wie zum Beispiel Mukoviszidose.
„Es ist ein neuer genetischer Weg, diese wirklich schwer zu behandelnden Krankheiten potenziell anzugreifen“, sagt Omar Abudayyeh, ein McGovern Fellow am McGovern Institute for Brain Research des MIT. „Wir wollten auf das hinarbeiten, was die Gentherapie ursprünglich tun sollte, nämlich Gene ersetzen und nicht nur einzelne Mutationen korrigieren.“
Das neue Werkzeug kombiniert das präzise Targeting von CRISPR-Cas9, einer Reihe von Molekülen, die ursprünglich aus bakteriellen Abwehrsystemen stammen, mit Enzymen, den sogenannten Integrasen, die Viren verwenden, um ihr eigenes genetisches Material in ein bakterielles Genom einzufügen.
„Genau wie CRISPR stammen diese Integrasen aus dem andauernden Kampf zwischen Bakterien und den Viren, die sie infizieren“, sagt Jonathan Gootenberg, ebenfalls ein McGovern Fellow. „Es spricht dafür, wie wir in diesen natürlichen Systemen immer wieder eine Fülle interessanter und nützlicher neuer Werkzeuge finden können.“
Gootenberg und Abudayyeh sind die leitenden Autoren der neuen Studie, die heute in erscheint Naturbiotechnologie. Die Hauptautoren der Studie sind die technischen Mitarbeiter des MIT Matthew Yarnall und Rohan Krajeski, die ehemalige MIT-Studentin Eleonora Ioannidi und der MIT-Student Cian Schmitt-Ulms.
DNA-Einfügung
Das CRISPR-Cas9-Geneditierungssystem besteht aus einem DNA-schneidenden Enzym namens Cas9 und einem kurzen RNA-Strang, der das Enzym zu einem bestimmten Bereich des Genoms führt und Cas9 anweist, wo es seinen Schnitt machen soll. Wenn Cas9 und die Leit-RNA, die auf ein Krankheitsgen abzielt, in Zellen eingebracht werden, wird ein spezifischer Schnitt im Genom vorgenommen, und die DNA-Reparaturprozesse der Zellen kleben den Schnitt wieder zusammen, wobei häufig ein kleiner Teil des Genoms gelöscht wird.
Wird zusätzlich eine DNA-Vorlage mitgeliefert, können die Zellen während des Reparaturprozesses eine korrigierte Kopie in ihr Erbgut einbauen. Dieser Prozess erfordert jedoch, dass Zellen doppelsträngige Brüche in ihrer DNA vornehmen, was zu chromosomalen Deletionen oder Umlagerungen führen kann, die für Zellen schädlich sind. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass es nur in sich teilenden Zellen funktioniert, da sich nicht teilende Zellen keine aktiven DNA-Reparaturprozesse haben.
Das MIT-Team wollte ein Werkzeug entwickeln, mit dem ein defektes Gen herausgeschnitten und durch ein neues ersetzt werden kann, ohne dass doppelsträngige DNA-Brüche verursacht werden. Um dieses Ziel zu erreichen, wandten sie sich einer Familie von Enzymen namens Integrasen zu, die Viren, sogenannte Bakteriophagen, verwenden, um sich in bakterielle Genome einzufügen.
Für diese Studie konzentrierten sich die Forscher auf Serin-Integrasen, die riesige DNA-Stücke von bis zu 50.000 Basenpaaren einfügen können. Diese Enzyme zielen auf spezifische Genomsequenzen ab, die als Bindungsstellen bekannt sind und als „Landeplätze“ fungieren. Wenn sie den richtigen Landeplatz im Wirtsgenom finden, binden sie daran und integrieren ihre DNA-Nutzlast.
In früheren Arbeiten haben Wissenschaftler es als schwierig empfunden, diese Enzyme für die Humantherapie zu entwickeln, da die Landeplätze sehr spezifisch sind und es schwierig ist, Integrasen neu zu programmieren, um auf andere Stellen abzuzielen. Das MIT-Team erkannte, dass die Kombination dieser Enzyme mit einem CRISPR-Cas9-System, das die richtige Landestelle einfügt, eine einfache Neuprogrammierung des leistungsstarken Einführsystems ermöglichen würde.
Das neue Werkzeug PASTE (Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements) enthält ein Cas9-Enzym, das an einer bestimmten genomischen Stelle schneidet, geführt von einem RNA-Strang, der an diese Stelle bindet. Dies ermöglicht es ihnen, jede Stelle im Genom für die Insertion der Landestelle anzusteuern, die 46 DNA-Basenpaare enthält. Diese Insertion kann ohne Einführen von Doppelstrangbrüchen erfolgen, indem zuerst ein DNA-Strang über eine fusionierte reverse Transkriptase und dann sein komplementärer Strang hinzugefügt wird.
Sobald die Landestelle eingebaut ist, kann die Integrase daherkommen und ihre viel größere DNA-Nutzlast an dieser Stelle in das Genom einfügen.
„Wir denken, dass dies ein großer Schritt in Richtung des Traums der programmierbaren Einfügung von DNA ist“, sagt Gootenberg. „Es ist eine Technik, die leicht sowohl an den Standort, den wir integrieren möchten, als auch an die Ladung angepasst werden kann.“
Gen-Ersatz
In dieser Studie zeigten die Forscher, dass sie mit PASTE Gene in mehrere Arten menschlicher Zellen einfügen konnten, darunter Leberzellen, T-Zellen und Lymphoblasten (unreife weiße Blutkörperchen). Sie testeten das Abgabesystem mit 13 verschiedenen Payload-Genen, darunter einige, die therapeutisch nützlich sein könnten, und konnten sie an neun verschiedenen Stellen im Genom einfügen.
In diese Zellen konnten die Forscher Gene mit einer Erfolgsquote von 5 bis 60 Prozent einschleusen. Dieser Ansatz führte auch zu sehr wenigen unerwünschten „Indels“ (Insertionen oder Deletionen) an den Stellen der Genintegration.
„Wir sehen sehr wenige Indels, und weil wir keine Doppelstrangbrüche machen, müssen Sie sich keine Sorgen über chromosomale Umlagerungen oder großflächige Deletionen von Chromosomenarmen machen“, sagt Abudayyeh.
Die Forscher zeigten auch, dass sie Gene in „humanisierte“ Lebern von Mäusen einfügen konnten. Die Lebern dieser Mäuse bestehen zu etwa 70 Prozent aus menschlichen Hepatozyten, und PASTE integrierte erfolgreich neue Gene in etwa 2,5 Prozent dieser Zellen.
Die DNA-Sequenzen, die die Forscher in diese Studie einfügten, waren bis zu 36.000 Basenpaare lang, aber sie glauben, dass auch noch längere Sequenzen verwendet werden könnten. Ein menschliches Gen kann einige hundert bis mehr als 2 Millionen Basenpaare umfassen, obwohl für therapeutische Zwecke nur die codierende Sequenz des Proteins verwendet werden muss, wodurch die Größe des DNA-Segments, das in das Genom eingefügt werden muss, drastisch reduziert wird.
Die Forscher untersuchen nun weiter die Möglichkeit, dieses Werkzeug als einen möglichen Weg zu verwenden, um das defekte Mukoviszidose-Gen zu ersetzen. Diese Technik könnte auch zur Behandlung von Blutkrankheiten nützlich sein, die durch fehlerhafte Gene verursacht werden, wie Hämophilie und G6PD-Mangel, oder der Huntington-Krankheit, einer neurologischen Störung, die durch ein defektes Gen mit zu vielen Genwiederholungen verursacht wird.
Die Forscher haben auch ihre genetischen Konstrukte zur Verfügung gestellt online für andere Wissenschaftler zu verwenden.
„Eines der fantastischen Dinge bei der Konstruktion dieser molekularen Technologien ist, dass Menschen darauf aufbauen, sie entwickeln und auf eine Weise anwenden können, an die wir vielleicht nicht gedacht haben oder die wir nicht in Betracht gezogen haben“, sagt Gootenberg. „Es ist wirklich großartig, Teil dieser aufstrebenden Gemeinschaft zu sein.“
Mehr Informationen:
Omar Abudayyeh, Drag-and-Drop-Genominsertion großer Sequenzen ohne doppelsträngige DNA-Spaltung mit CRISPR-gesteuerten Integrasen, Naturbiotechnologie (2022). DOI: 10.1038/s41587-022-01527-4. www.nature.com/articles/s41587-022-01527-4
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