In einer Studie veröffentlicht In NaturkommunikationDie Gruppe von Prof. Chao Yanjie am Institut für Immunität und Infektion der Chinesischen Akademie der Wissenschaften in Shanghai berichtete über eine neuartige RNA-Interaktom-Profiling-Technologie (iRIL-seq), die molekulare RNA-RNA-Interaktionen in lebenden mikrobiellen Zellen identifiziert.
Mithilfe von iRIL-seq kartierten die Forscher erstmals die RNA-RNA-Interaktomnetzwerke von Salmonella enterica in verschiedenen Wachstumsstadien und entdeckten viele neuartige nichtkodierende RNAs und wichtige mRNA-Regulierungszentren.
Die direkte RNA-RNA-Interaktion ist ein Hauptmechanismus, durch den nichtkodierende RNAs ihre Funktionen ausüben. In prokaryotischen Zellen erkennen nichtkodierende kleine RNAs Ziel-mRNAs durch sehr kurze und unvollständige Basenpaarungswechselwirkungen, die schwer vorherzusagen und zu identifizieren sind.
Bakterielle nichtkodierende RNAs haben wichtige regulatorische Funktionen, steuern die Expression vieler Zielgene auf der posttranskriptionellen Ebene und spielen eine entscheidende Rolle bei vielen biologischen Prozessen, wie bakterieller Infektion, Antibiotikaresistenz, Zentralstoffwechsel, Stressreaktion, Quorum Sensing, und Biofilmbildung.
Die Analyse des RNA-RNA-Interaktionsnetzwerks ist für die Untersuchung der mikrobiellen Physiologie und der Funktionen nichtkodierender RNAs von großer Bedeutung. Allerdings sind die bestehenden RNA-RNA-Interaktom-Profilierungstechniken kompliziert und erfordern fixierte Zellen und zahlreiche In-vitro-Schritte wie RNA-Verdau, -Reparatur und -Ligation, was zu unzureichenden RNA-Wechselwirkungen mit geringer Auflösung und Genauigkeit führt.
In dieser Studie entwickelten die Forscher einen neuartigen In-vivo-RNA-Proximity-Ligation-Ansatz, iRIL-seq (intrazelluläre RNA-Interaktion durch Ligation und Sequenzierung).
Die Forscher induzierten zunächst die Expression der T4-RNA-Ligase in lebenden mikrobiellen Zellen, was in vivo zur Proximity-Ligation zwischen interagierenden RNA-Molekülen führt. Anschließend reicherten sie die nichtkodierenden kleinen RNAs und ihre interagierenden Transkripte durch Immunpräzipitation des wichtigsten kleinen RNA-Chaperons Hfq an.
Mithilfe der Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung bestimmten sie außerdem die Identität und Sequenz der interagierenden RNA-Moleküle. Der Hauptversuchsprozess kann dank der schnellen In-vivo-Ligation und des optimierten Arbeitsablaufs innerhalb eines einzigen Tages abgeschlossen werden.
Diese neue Technologie veranschaulicht nicht nur den Atlas eines mikrobiellen RNA-RNA-Interaktionsnetzwerks, sondern identifiziert auch RNA-RNA-Basenpaarungsinteraktionen mit Einzelnukleotidauflösung. Die iRIL-seq-Technologie ist eine einfache, schnelle, genaue und universelle Technologie zur Analyse der RNA-RNA-Wechselwirkungen in Mikroorganismen und bietet eine neue Möglichkeit zur Untersuchung von RNA-RNA-Wechselwirkungen in eukaryotischen Zellen.
Darüber hinaus kartierten die Forscher zum ersten Mal die dynamischen RNA-RNA-Interaktome des bakteriellen Krankheitserregers Salmonella enterica in mehreren Wachstumsstadien, identifizierten mehr als 2.000 RNA-RNA-Interaktionen und entdeckten viele wichtige mRNA-Regulationszentren. Es wurde gezeigt, dass der bisher größte mRNA-Regulierungsknotenpunkt in Bakterien die mRNA ist, die für das Außenmembranporin OmpD kodiert, das von mindestens 12 verschiedenen nicht-kodierenden kleinen RNAs reguliert wird.
Die experimentelle Charakterisierung dieser kleinen RNAs führte zur Identifizierung eines neuen kleinen RNA-FadZ, das durch Ribonuklease von einer mRNA 3’UTR abgespalten wird. Die Expression von FadZ und seiner parentalen fadBA-mRNA wurde durch die vorgeschalteten Transkriptionsfaktoren FadR, CRP und langkettige Fettsäuresignale reguliert.
Unter Bedingungen langkettiger Fettsäuren wurden sowohl FadZ-sRNA als auch ihr Zielgen ompD durch den Transkriptionsfaktor CRP aktiviert und bildeten zusammen eine inkohärente Feed-Forward-Schleife vom Typ I (I1-FFL). Der Befund enthüllte den posttranskriptionellen Regulationsmechanismus von Bakterien als Reaktion auf den Stoffwechsel langkettiger Fettsäuren in Wirten.
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Fang Liu et al., In-vivo-RNA-Interaktomprofilierung zeigt 3’UTR-prozessierte kleine RNA, die auf einen zentralen regulatorischen Knotenpunkt abzielt. Naturkommunikation (2023). DOI: 10.1038/s41467-023-43632-1