Ein Forschungsteam der LKS-Fakultät für Medizin der Universität Hongkong (HKUMed) hat eine neue Methode entwickelt, um den derzeit begrenzten Durchsatz bei der Optimierung präziser Genom-Editoren im großen Maßstab zu durchbrechen und Hunderte (oder mehr) Basis-Editor-Varianten zu entwickeln parallel statt über die derzeit aufwändigen Einzeltests durchführen und Benutzer darüber informieren, welche für die therapeutische Genombearbeitung am besten geeignet sind. Der Befund wurde veröffentlicht in Zellsysteme Basierend auf dieser Arbeit wurde eine Patentanmeldung eingereicht.
Base Editing ist eine neuere CRISPR-basierte Genomeditierungstechnologie und erweist sich als sichereres Instrument zur Bekämpfung genetischer Krankheiten mit Einzelbasenmutationen (wie Sichelzellenanämie, familiäre Hypercholesterinämie usw.) in der DNA, indem sie in ihre normale Form korrigiert werden .
Allerdings kann die bestehende Baseneditierung je nach Typ und Version des verwendeten Baseneditors, der Sequenzzusammensetzung der Ziel-DNA und der Position der zu konvertierenden DNA-Base(n) zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Die Auswahl eines nicht optimalen Baseneditors für die Anwendung kann zu falschen Bearbeitungen und zusätzlichen Mutationen rund um die Ziel-DNA-Base führen, was zu unerwünschten Effekten führen kann.
Derzeit müssen mühsame, ausführliche Einzeltests durchgeführt werden, um die Bearbeitungsleistung der Dutzenden verfügbaren Basiseditoren zu charakterisieren und deren Verwendung an jedem therapeutischen Ort zu optimieren. Darüber hinaus verfügen viele therapeutische Loci noch nicht über einen optimierten Basiseditor zur präzisen Bearbeitung. Trotz weltweiter Bemühungen kann die Erstellung eines neuen Basiseditors mit herkömmlichen Methoden Monate oder Jahre dauern.
Das Forschungsteam von HKUMed hat erfolgreich eine Plattform entwickelt, die ein Base-Editor-Reportersystem mit CombiSEAL koppelt, einer hochmodernen Technologie, die zuvor entwickelt wurde, um schnell Hunderte (oder mehr) Base-Editor-Varianten parallel mit Kombinationen verschiedener enzymatischer Desaminasedomänen zu entwickeln CRISPR/Cas9-basierte DNA-Erkennungsdomänen. Die Kompatibilität und Leistung dieser Varianten wurde noch nicht direkt charakterisiert und verglichen.
Das Team nutzte die Plattform, um die Bearbeitungseffizienz, Reinheit, Sequenzmotivpräferenz und Tendenz bei der Generierung einzelner und mehrerer Basenumwandlungen in menschlichen Zellen quantitativ auszulesen, was dabei hilft, die am besten geeigneten Basenumwandlungen für das therapeutische Ziel auszuwählen, indem eine bestimmte Art von Basenumwandlung erzeugt wird mit maximaler Effizienz und minimalen unerwünschten Bearbeitungen.
Das Team erweiterte die Nutzung der Plattform, um die Effizienz des aktuellen Basiseditorsystems weiter zu steigern. Die Teammitglieder führten ein Screening durch, bei dem der Schwerpunkt auf der Entwicklung der Stamm-Loop-2-Region des sgRNA-Gerüsts (einer einzelnen Leit-RNA) lag, das im Basiseditorsystem verwendet wird, und identifizierten erfolgreich zwei neue sgRNA-Gerüstvarianten, SV48 und SV240, die die Wildform übertrafen -Typ-Gerüst, um eine höhere (bis zu 2,2-fach höhere) Basisbearbeitungseffizienz zu erreichen.
Darüber hinaus zeigte das Team, dass die Plattform nicht nur zur Charakterisierung und zum Screening von Basiseditoren verwendet werden kann, sondern auch mit anderen präzisen Genomeditorsystemen wie Prime Editoren kompatibel ist. Dies könnte den Umfang der Suche nach anderen geeigneten Editoren erweitern, um genetische Mutationen an therapeutischen Zielen zu korrigieren, bei denen ein Basiseditor nicht anwendbar ist.
Diese Plattform beschleunigt die Entwicklung präziser Genom-Editoren der nächsten Generation und die Anpassung dieser Editoren an künftige therapeutische Anwendungen.
„Es ist wie ein beschleunigter Checkout-Prozess in Geschäften. Da alle Produktartikel (d. h. Basiseditor-Varianten) mit einem Barcode gekennzeichnet sind, müssen wir beim Barcodescanner an der Kasse nur alle Artikel in großen Mengen in den Warenkorb legen „Der Scanner kann automatisch alle Artikel identifizieren und die Zahlung abschließen (in unserem Fall die Analyse der Basisbearbeitungsleistung). Es besteht keine Notwendigkeit, jeden Basiseditor einzeln einzeln zu testen“, sagt Dr. Alan Wong Siu-lun , außerordentlicher Professor der School of Biomedical Sciences, HKUMed, erklärte.
Die Forschung wurde von Dr. Alan Wong Siu-lun, außerordentlicher Professor, School of Biomedical Sciences, HKUMed, geleitet. John Fong Hoi-chun, Ph.D. Student, war Erstautor, mit Unterstützung von Dr. Chu Hoi-yee und Dr. Zhou Peng, Postdoktoranden, School of Biomedical Sciences, HKUMed.
Mehr Informationen:
John HC Fong et al., Paralleles Engineering und Aktivitätsprofilierung eines Basiseditorsystems, Zellsysteme (2023). DOI: 10.1016/j.cels.2023.03.007