Neue Methoden leuchten Lipidmembranen und ermöglichen eine hochauflösende Proteinkartierung

In der Biologie kann das Sehen zu Verständnis führen, und Forscher in Professor Edward Boydens Labor am McGovern -Institut für Gehirnforschung sind verpflichtet, das Leben in schärferen Fokus zu bringen. Mit zwei neuen Methoden erweitern sie die Fähigkeiten der Expansionsmikroskopie-eine hochauflösende Bildgebungstechnik, die die Gruppe 2015 eingeführt hat-, sodass Forscher überall mehr sehen können, wenn sie Zellen und Gewebe unter einem Lichtmikroskop betrachten.

„Wir wollen alles sehen, also versuchen wir immer, es zu verbessern“, sagt Boyden, der Y. Eva Tan -Professor für Neurotechnologie am MIT. „Ein Schnappschuss aller Leben, bis hin zu seinen grundlegenden Bausteinen, ist wirklich das Ziel.“ Boyden ist auch ein Howard Hughes Medical Institute Investigator und Mitglied des Yang Tan -Kollektivs am MIT.

Mit neuen Möglichkeiten, ihre Proben zu färben und Bilder zu verarbeiten, können Benutzer der Expansionsmikroskopie nun lebendige Umrisse der Zellenformen in ihren Bildern sehen und die Stellen vieler verschiedener Proteine ​​in einer einzelnen Gewebeprobe mit Auflösung bestimmen, die die der herkömmlichen Lichtmikroskopie weit überschreitet. Diese Fortschritte, die beide in Open-Access-Form im Journal gemeldet wurden NaturkommunikationErmöglichen Sie neue Wege, um die schlanken Projektionen von Neuronen nachzuverfolgen und räumliche Beziehungen zwischen Molekülen zu visualisieren, die zu Gesundheit und Krankheit beitragen.

Die Expansionsmikroskopie verwendet ein wasserabsorbierendes Hydrogel, um biologische Gewebe physisch zu erweitern. Nachdem eine Gewebeprobe vom Hydrogel durchdrungen wurde, ist sie hydratisiert. Das Hydrogel schwillt an, während es Wasser absorbiert und die relativen Stellen von Molekülen im Gewebe bewahrt, während es sie sanft voneinander wegzieht.

Infolgedessen erscheinen überfüllte zelluläre Komponenten getrennt und unterschiedlich, wenn das erweiterte Gewebe unter einem Lichtmikroskop betrachtet wird. Der Ansatz, der mit Standardlaborgeräten durchgeführt werden kann, hat den meisten Forschungsteams eine Superauflösung zugänglich gemacht.

Seit der ersten Entwicklung der Expansionsmikroskopie haben Boyden und sein Team die Methode weiter verbessert – in der Auflösung, die Vereinfachung des Verfahrens, die Entwicklung neuer Merkmale und die Integration in andere Tools.

Visualisierung von Zellmembranen

Eine der neuesten Fortschritte des Teams ist eine Methode, die als Ultrastrukturmembranerweiterungsmikroskopie (UMEXM) bezeichnet wird, die sie beschrieben in der Ausgabe vom 12. Februar von Naturkommunikation.

Mithilfe von Biologen können Biologen eine Expansionsmikroskopie verwenden, um die dünnen Membranen zu visualisieren, die die Grenzen von Zellen bilden und die in ihnen befindlichen Organellen einschließen. Diese Membranen, die hauptsächlich aus Molekülen gebaut wurden, die als Lipide bezeichnet werden, waren es notorisch schwer, in intakten Geweben für die Bildgebung mit Lichtmikroskopie intakten Geweben dicht zu kennzeichnen. Jetzt können Forscher UMEXM verwenden, um die zelluläre Ultrastruktur und Organisation innerhalb von Geweben zu untersuchen.

Tay Shin Sm ’20, Ph.D. ’23, ein ehemaliger Doktorand in Boydens Labor und J. Douglas Tan Fellow im Tan-Yang Center for Autism Research am MIT, leitete die Entwicklung von UMEXM. „Unser Ziel war zunächst sehr einfach: Beschriften wir Membranen in intaktem Gewebe, ähnlich wie ein Elektronenmikroskop Osmium Tetroxid verwendet, um Membranen zu kennzeichnen, um die Membranen im Gewebe zu visualisieren“, sagt er. „Es stellt sich heraus, dass es extrem schwierig ist, dies zu erreichen.“

Das Team musste zunächst ein Etikett entwerfen, das die Membranen in Gewebeproben unter einem leichten Mikroskop sichtbar machen würde. „Wir mussten fast von vorne anfangen“, sagt Shin. „Wir mussten wirklich über die grundlegenden Eigenschaften der Sonde nachdenken, die die Plasmamembran kennzeichnen und dann darüber nachdenken, wie sie in die Expansionsmikroskopie einbezogen werden können.“ Dies bedeutete, ein Molekül zu entwickeln, das mit den Lipiden assoziierten, aus denen die Membran besteht, und es sowohl mit dem Hydrogel verwendet, um die Gewebeprobe zu erweitern, als auch mit einem fluoreszierenden Molekül für die Sichtbarkeit.

Nach der Optimierung des Expansionsmikroskopieprotokolls für die Membranvisualisierung und das umfassende Testen und Verbesserung potenzieller Sonden fand Shin eine späte Nacht im Labor. Er legte eine erweiterte Gewebeprobe auf ein Mikroskop und sah scharfe Umrisse von Zellen.

Aufgrund der durch Erweiterung ermöglichten hohen Auflösung ermöglichte es bei der Methode Boydens Team, selbst die winzigen Dendriten zu identifizieren, die aus Neuronen herausragen und die langen Verlängerungen ihrer schlanken Axone deutlich sehen. Diese Art der Klarheit könnte den Forschern helfen, die Wege der einzelnen Neuronen in den dicht verbundenen Netzwerken des Gehirns zu folgen, sagen die Forscher.

Boyden nennt die Verfolgung dieser neuronalen Prozesse „eine oberste Priorität unserer Zeit in der Gehirnwissenschaft“. Eine solche Verfolgung hat sich traditionell stark auf die Elektronenmikroskopie verlassen, was spezielle Fähigkeiten und teure Geräte erfordert. Shin sagt, dass die Expansionsmikroskopie ein Standard -Lichtmikroskop verwendet, es für Laboratorien weltweit weitaus zugänglicher ist.

Shin und Boyden weisen darauf hin, dass Benutzer der Expansionsmikroskopie noch mehr über ihre Proben erfahren können, wenn sie die neue Fähigkeit, Lipidmembranen mit fluoreszierenden Etiketten aufzudecken, die zeigen, wo sich bestimmte Proteine ​​befinden. „Das ist wichtig, denn Proteine ​​erledigen viel von der Zelle, aber Sie möchten wissen, wo sie in Bezug auf die Struktur der Zelle sind“, sagt Boyden.

Eine Probe, viele Proteine

Zu diesem Zweck müssen Forscher nicht mehr nur wenige Proteine ​​auswählen, um zu erkennen, wann sie eine Expansionsmikroskopie verwenden. Mit einer neuen Methode namens Multiplexed Expansion Discovering (MultiexR) können Benutzer nun kennzeichnen und in einer einzelnen Probe mehr als 20 verschiedene Proteine ​​sehen. Biologen können die Methode verwenden, um Proteinesätze zu visualisieren, zu sehen, wie sie in Bezug aufeinander organisiert sind, und neue Hypothesen darüber erzeugen, wie sie interagieren könnten.

Ein Schlüssel zu dieser neuen Methode, gemeldet 9. November 2024 in Naturkommunikationist die Fähigkeit, fluoreszenzmarkierte Antikörper wiederholt mit bestimmten Proteinen in einer erweiterten Gewebeprobe zu verknüpfen, sie abzubilden, diese dann wegzuziehen und einen neuen Satz von Antikörpern zu verwenden, um einen neuen Satz von Proteinen zu enthüllen. Postdoc Jinyoung Kang fein abgestimmt jeden Schritt dieses Prozesses und versicherte, dass Gewebeproben intakt blieb und die markierten Proteine ​​in jeder Bildgebung helle Signale erzeugten.

Nachdem Boydens Team viele Bilder einer einzelnen Probe aufgenommen hatte, stand es einer weiteren Herausforderung: Wie man sicherstellen kann, dass diese Bilder in perfekter Ausrichtung waren, damit sie miteinander überlagert werden konnten und ein endgültiges Bild erzeugt werden, das die genauen Positionen aller Proteine ​​zeigte, die markiert und einzeln bezeichnet wurden.

Durch die Expansionsmikroskopie können Biologen einige der kleinsten Merkmale der Zellen sichtbar machen – aber in mehreren Runden der Bildgebung immer wieder dieselben Merkmale zu finden, musste das Team von Boyden zunächst in einer größeren Struktur zu Hause nach Hause mussten. „Diese Sichtfelder sind wirklich winzig, und Sie versuchen, dieses wirklich winzige Sichtfeld in einem Gel zu finden, das tatsächlich ziemlich groß geworden ist, wenn Sie es erweitert haben“, erklärt Margaret Schroeder, eine Doktorandin in Boydens Labor, die mit Kang die Entwicklung von Multiexr leitete.

Um jedes Mal zum richtigen Ort zu navigieren, beschloss das Team, die Blutgefäße zu kennzeichnen, die jede Gewebeprobe durchlaufen und diese als Leitfaden verwenden. Um eine genaue Ausrichtung zu ermöglichen, mussten auch bestimmte feine Details in jedem Bild konsequent erscheinen. Dafür bezeichnete das Team mehrere Strukturproteine. Mit diesen Referenzpunkten und einer angepassten Bildgebungs -Verarbeitungssoftware konnte das Team alle ihre Bilder einer Stichprobe in eine integrieren und enthüllen, wie Proteine, die separat visualisiert wurden, relativ zueinander angeordnet wurden.

Das Team verwendete Multiexr, um sich Amyloid -Plaques zu untersuchen – die aberranten Proteincluster, die sich im von der Alzheimer betroffenen Gehirn bekanntermaßen entwickeln. „Wir könnten in diese Amyloid-Plaques schauen und fragen, was in ihnen ist? Und weil wir für viele verschiedene Proteine ​​flecken können, könnten wir eine Hochdurchsatz-Erkundung durchführen“, sagt Boyden. Das Team wählte 23 verschiedene Proteine ​​aus, um in ihren Bildern zu sehen. Der Ansatz ergab einige Überraschungen, wie das Vorhandensein bestimmter Neurotransmitter -Rezeptoren (AMPARs).

„Hier ist einer der berühmtesten Rezeptoren in der gesamten Neurowissenschaften, und es gibt es in einem der berühmtesten molekularen Kennzeichen der Pathologie in der Neurowissenschaft“, sagt Boyden. Es ist unklar, welche Rolle die Rezeptoren bei der Alzheimer -Krankheit, wenn überhaupt, spielen – aber der Befund zeigt, wie die Fähigkeit, mehr innerhalb von Zellen zu sehen, unerwartete Aspekte der Biologie aufdecken und neue Fragen für die Forschung aufwerfen kann.

Diese Geschichte wird mit freundlicher Genehmigung von MIT News neu veröffentlicht (web.mit.edu/newsoffice/), eine beliebte Website, die Nachrichten über MIT -Forschung, Innovation und Lehre abdeckt.