Neue Methoden der Expansionsmikroskopie verstärken die Wirkung der Forschung

Dank Innovationen in der Expansionsmikroskopie sind jetzt beispiellose Einblicke in das Innere von Zellen und anderen nanoskaligen Strukturen möglich. Die Fortschritte könnten dazu beitragen, zukünftige Einblicke in die Neurowissenschaften, die Pathologie und viele andere biologische und medizinische Bereiche zu gewähren.

In der am 2. Januar in der Zeitschrift veröffentlichten Veröffentlichung „Magnify is a universal Molecular Anchoring Strategy for Expansion Microscopy“. NaturbiotechnologieMitarbeiter der Carnegie Mellon University, der University of Pittsburgh und der Brown University beschreiben neue Protokolle für Magnify.

„Magnify kann ein wirksames und zugängliches Werkzeug für die Biotechnologie-Community sein“, sagte Yongxin (Leon) Zhao, außerordentlicher Professor für biologische Wissenschaften bei Eberly Family Career Development.

Das Biophotonik-Labor von Zhao ist führend auf dem Gebiet der Ermöglichung der superauflösenden Bildgebung biologischer Proben durch physikalische Ausdehnung von Proben in einem Prozess, der als Ausdehnungsmikroskopie bekannt ist. Durch den Prozess werden die Proben in ein quellbares Hydrogel eingebettet, das sich homogen ausdehnt, um den Abstand zwischen den Molekülen zu vergrößern, sodass sie mit größerer Auflösung beobachtet werden können. Dadurch können nanoskalige biologische Strukturen, die bisher nur mit teuren hochauflösenden Bildgebungsverfahren betrachtet werden konnten, mit Standard-Mikroskopiewerkzeugen sichtbar gemacht werden.

Magnify ist eine Variante der Expansionsmikroskopie, die es Forschern ermöglicht, eine neue, von Zhaos Team erfundene Hydrogelformel zu verwenden, die ein Spektrum von Biomolekülen beibehält, eine breitere Anwendung auf eine Vielzahl von Geweben bietet und die Expansionsrate bis zu 11-mal linear oder linear erhöht ~1.300 Falten des Originalvolumens.

„Wir haben einige der langjährigen Herausforderungen der Expansionsmikroskopie gemeistert“, sagte Zhao. „Eines der Hauptverkaufsargumente für Magnify ist die universelle Strategie, die Biomoleküle des Gewebes, einschließlich Proteine, Zellkernschnipsel und Kohlenhydrate, in der erweiterten Probe zu halten.“

Zhao sagte, dass es wichtig sei, verschiedene biologische Komponenten intakt zu halten, da frühere Protokolle die Eliminierung vieler verschiedener Biomoleküle erforderten, die Gewebe zusammenhielten. Aber diese Moleküle könnten wertvolle Informationen für Forscher enthalten.

„Um Zellen wirklich dehnbar zu machen, musste man früher Enzyme verwenden, um Proteine ​​zu verdauen, also hatte man am Ende ein leeres Gel mit Etiketten, die die Position des interessierenden Proteins anzeigen“, sagte er. Mit der neuen Methode bleiben die Moleküle intakt und mehrere Arten von Biomolekülen können in einer einzigen Probe markiert werden.

„Früher war es so, als hätte man Single-Choice-Fragen. Wenn man Proteine ​​markieren möchte, wäre das das Version-1-Protokoll. Wenn man Kerne markieren möchte, wäre das eine andere Version“, sagte Zhao. „Wenn Sie simultane Aufnahmen machen wollten, war das schwierig. Jetzt können Sie mit Magnify mehrere Elemente zum Etikettieren auswählen, z. B. Proteine, Lipide und Kohlenhydrate, und sie zusammen abbilden.“

Die Laborforscher Aleksandra Klimas, eine Postdoktorandin, und Brendan Gallagher, ein Doktorand, waren die ersten Co-Autoren des Papiers.

„Dies ist eine zugängliche Möglichkeit, Proben in hoher Auflösung abzubilden“, sagte Klimas. „Traditionell benötigt man teure Ausrüstung und spezielle Reagenzien und Schulungen. Diese Methode ist jedoch auf viele Arten der Probenvorbereitung anwendbar und kann mit Standardmikroskopen betrachtet werden, die man in einem Biologielabor hätte.“

Gallagher, der einen Hintergrund in Neurowissenschaften hat, sagte, ihr Ziel sei es, die Protokolle so kompatibel wie möglich für Forscher zu machen, die von der Übernahme des Magnify als Teil ihrer Toolkits profitieren könnten.

„Eines der Schlüsselkonzepte, das wir im Hinterkopf behalten wollten, war, die Forscher dort abzuholen, wo sie sind, und sie so wenig Dinge wie möglich in ihren Protokollen ändern zu lassen“, sagte Gallagher. „Es funktioniert mit verschiedenen Gewebetypen, Fixierungsmethoden und sogar mit konserviertem und gelagertem Gewebe. Es ist sehr flexibel, da Sie Experimente mit Magnify nicht unbedingt komplett neu gestalten müssen; es funktioniert mit dem, was Sie bereits haben .“

Für Forscher wie Simon Watkins, den Gründer und Direktor des Center for Biological Imaging an der University of Pittsburgh und dem Pittsburgh Cancer Institute, ist die Tatsache, dass das neue Protokoll mit einer breiten Palette von Gewebetypen – einschließlich konservierter Gewebeschnitte – kompatibel ist wichtig. Beispielsweise sind die meisten Methoden der Expansionsmikroskopie für Hirngewebe optimiert. Im Gegensatz dazu wurde Magnify an Proben aus verschiedenen menschlichen Organen und entsprechenden Tumoren, einschließlich Brust, Gehirn und Dickdarm, getestet.

„Nehmen wir an, Sie haben ein Gewebe mit dichten und nicht dichten Komponenten, das umgeht Gewebe, das sich zuvor nicht isometrisch ausdehnen würde“, sagte Watkins. „Leon hat hart daran gearbeitet, damit dieses Protokoll mit archivierten Geweben funktioniert.“

Xi (Charlie) Ren, Assistenzprofessor für Biomedizintechnik an der Carnegie Mellon, untersucht das Lungengewebe und wie man seine Morphogenese und Pathogenese modelliert. Ein Teil seiner Forschung umfasst die Erforschung der beweglichen Zilien, die dazu dienen, Schleim in den Atemwegen des Menschen zu entfernen. Mit 200 Nanometern Durchmesser und wenigen Mikrometern Länge sind die Strukturen zu klein, um sie ohne zeitaufwändige Technik wie die Elektronenmikroskopie zu sehen. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Zhao entwickelte und lieferte Rens Team Lungen-Organoid-Modelle mit spezifischen Defekten in der Zilien-Ultrastruktur und -Funktion, um die Fähigkeit von Magnify zur Visualisierung klinisch relevanter Zilien-Pathologie zu validieren.

„Mit den neuesten Magnify-Techniken können wir dieses Lungengewebe erweitern und sogar mit einem normalen Mikroskop eine gewisse Ultrastruktur der beweglichen Flimmerhärchen sehen, und dies wird sowohl grundlegende als auch klinische Untersuchungen beschleunigen“, sagte er.

Die Forscher waren auch in der Lage, Defekte in Zilien in patientenspezifischen Lungenzellen zu sehen, von denen bekannt ist, dass sie genetische Mutationen aufweisen.

„Die Community der Lungengewebezüchtung braucht immer eine bessere Möglichkeit, das Gewebesystem, mit dem wir arbeiten, zu charakterisieren“, sagte Ren. Er fügte hinzu, dass diese Arbeit ein wichtiger erster Schritt sei und er hofft, dass die Zusammenarbeit mit Zhaos Labor weiter verfeinert und auf pathologische Proben angewendet wird, die in Gewebebanken gefunden werden.

Schließlich ist das in Magnify verwendete und im Zhao-Labor entwickelte Hydrogel robuster als sein Vorgänger, der sehr zerbrechlich war und während des Prozesses Brüche verursachte.

„Wir hoffen, diese Technologie entwickeln zu können, um sie der Community zugänglicher zu machen“, sagte er. „Das kann in verschiedene Richtungen gehen. Es besteht großes Interesse daran, diese Art von Gewebeexpansionstechnologie für die Grundlagenforschung einzusetzen.“

Alison Barth, Maxwell H. und Gloria C. Connan Professorin für Biowissenschaften an der Carnegie Mellon, untersucht die synaptische Konnektivität während des Lernens. Sie sagte, die breiten Anwendungsmöglichkeiten der neuen Methoden seien ein Segen für die Forscher.

„Das Gehirn ist ein großartiger Ort, um diese Superauflösungstechniken zu nutzen“, sagte Barth, der an mehreren Studien mit dem Zhao Lab zusammenarbeitet. „Mikroskopiemethoden werden für die synaptische Phänotypisierung und Analyse bei verschiedenen Gehirnzuständen von Vorteil sein.

„Einer der größten Fortschritte in diesem Papier ist die Fähigkeit der Methode, mit vielen verschiedenen Arten von Gewebeproben zu arbeiten.“

Weitere Studienautoren sind Piyumi Wijesekara, Emma F. DiBernardo, Zhangyu Cheng von Carnegie Mellon; Sinda Fekir und Christopher I. Moore von der Brown University; Donna B. Stolz von Pitt; Franca Cambi von Pitt and Veterans Administration; und Steven L. Brody und Amjad Horani von der Washington University.